Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM
BÁO CÁO THỰC HÀNH VI SINH
THỰC PHẨM
GVHD: BÙI HỒNG QUÂN
LỚP: ĐHTP5 – NHÓM 5
SVTH: Lê Thị Mỹ Vân
MSSV: 09078531
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2011
1
MỤC LỤC
Bài 1: Thiết bị, dụng cụ phòng thí nghiệm và các phương pháp
tiệt trùng vi sinh vật.................................................................................................3
Bài 2: Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật...............................6
Bài 3: Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật..............................................................10
Bài 4: phương pháp quan sát vi sinh vật bằng kính hiển vi quang học...............16
Bài 5: Phương pháp nhuộm màu vi sinh vật........................................................19
Bài 6: Phương pháp phân lập vi sinh vật..............................................................20
Bài 10: Khảo sát đặc tính sinh hóa của vi sinh vật...............................................23
Bài 13: Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm trực tiếp........................35
Bài 14: Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí bằng
phương pháp đếm khuẩn lạc..................................................................................37
Bài 15: Định lượng Coliform bằng phương pháp MPN.......................................39
Bài 19: Phương pháp định lượng E.coli trong thực phẩm...................................41
Bài 20: Phương pháp phân tích Salmonella spp. trong thực phẩm......................43
Bài 21: Phương pháp phân tích định lượng Bacillus cereus trong thực phẩm....46
Bài 22: Phương pháp phân tích định lượng Staphilococcus aureus
trong thực phẩm....................................................................................................48
Bài 24: Phương pháp phân tích Clostridium perfringens trong thực phẩm.........50
2
BÀI 1: THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT VÀ
CÁC PHƯƠNG PHÁP TIỆT TRÙNG VI SINH VẬT
Báo cáo thực tập
1. Trình bày yêu cầu của việc bao gói dụng cụ nuôi ấy vi sinh vật?
Yêu cầu của việc bao gói dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật:
-
Phần giấy bao bên ngoài phải chặt và kín
-
Bao bằng giấy dầu với dụng cụ hấp ướt
-
Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô khi khử trùng ướt.
- Với các dụng cụ như pipet, que trang phải dùng giấy bao kín toàn bộ. Có thể
dùng hộp nhôm để đựng các dụng cụ trên để khử trùng.
2. Công dụng và cách sử dụng các dụng cụ, thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh
vật?
Công dụng và cách sử dụng các dụng cụ, thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh
vật:
a. Nồi hấp ướt (autoclave):
Thiết bị này cấp nhiệt bằng hơi nước ở áp suất cao, được sử dụng để hấp khử trùng
mô trường, một số nguyên liệu và dụng cụ thí nghiệm.
b. Kính hiển vi:
Công dụng: dùng để nghiên cứu, quan sát tế bào vi sinh vật về đặc điểm hình thái,
sinh lý nhờ vào khả năng phóng đại của kính.
c. Các dụng cụ thí nghiệm
Dụng cụ thủy tinh có nhiều loại với nhiều kích cỡ khác nhau như bình tam giác,
ống nghiệm, đĩa petri, lam kính, đũa thủy tinh, que trang, ống đong, cốc đong, bình
định mức…
vật.
Phiến kính (lame): dùng làm tiêu bản quan sát hình thái, sinh lý tế bào vi sinh
- Lá kính (lamelle): dùng để đậy lên vết bôi trên tiêu bản cố định vi sinh vật
trong qua trình nghiên cứu.
- Đĩa petri: dùng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái, đặc điểm nuôi cấy và
phân lập của tế bào vi sinh vật.
3
-
Que trãi: phân lập vi sinh vật theo phương pháp trãi đĩa.
-
Que cấy:
+ Que cấy đầu tròn: dùng để thao tác vi sinh trên đối tượng đơn bào như vi
khuẩn, nấm men.
+ Que cấy nhón: dùng để cấy sâu trên môi trường rắn.
+ Que cấy móc: dùng để lấy khuẩn ty hay một đoạn tơ nấm.
-
Micro pipette: sử dụng khi cần hút một lượng chính xác môi trường.
4.Trình bày phương pháp tiệt trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy vi sinh vật?
Phương pháp tiệt trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy vi sinh vật:
a. Phương pháp lý học:
Nhiệt khô:
- Đối với dụng cụ cấy kim loại, đôi khi cả thủy tinh, phương pháp thường dùng
là đốt trục tiếp trên ngọn lửa đèn cồn.
- Đối với dụng cụ thủy tinh có thể gói và sấy ở 160 0C trong 1-2 giờ hoặc 1800C
trong 30 phút.
Nhiệt ẩm:
- Phương pháp luộc: cho vật khử trùng vào nước sôi, nhiệt sẽ thấm nhanh vào
mẫu vật làm cho protein đông kết, dẫn đến giết chết vi sinh vật. Chỉ diệt tế bào sinh
dưỡng, bào tử vẫn còn.
- Phương pháp Pasteur: chỉ diệt vi khuẩn gây bệnh, không diệt bào tử và vi
khuẩn hoại sinh. Phương pháp này thường dùng ở nhiệt độ 70-75 0C trong thời gian
10-15 phút.
- Phương pháp Tyndall: đun cách thủy nhiều lần ở nhiệt độ 70-80 0C, mỗi lần 3060 phút và liên tiếp trong ba ngày liền.
- Phương pháp hơi nước bão hòa ở áp suất cao: dùng autoclave. Thường dùng ở
nhiệt độ 1210C trong 15-30 phút.
Diệt trùng bức xạ:
-
Tia tử ngoại hay UV: chỉ sát trùng bề mặt, không xuyên sâu vào mẫu vật.
- Tia âm cực dùng trong tiệt trùng dụng cụ giải phẫu, thuốc, thực phẩm. Vật khử
trùng phải bao gói kính.
4
Diệt trung bằng cách lọc:
- Dụng cụ lọc thường là những màng xốp bằng sứ, aminate, cellulose,… có kích
thước lỗ lọc từ 0,2-0,45μm, thường dùng để lọc những vật phẩm lỏng không khử trùng
bằng nhiệt được.
- Đối với khử trùng không khí thì thiết bị khử trùng là một máy lọc khí có trang
bị màng lọc hay hấp phụ vi khuẩn.
b. Phương pháp hóa học.
-
Chỉ sát khuẩn ngoài da: xà phòng, cồn, iode, phẩm màu.
-
Chất diệt khuẩn và tẩy uế: phenol, formol, hợp chất clor…
5
BÀI 2: CÁCH PHA CHẾ CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG
I. TRẢ LỜI CÂU HỎI
1. Trình bày khái niệm môi trường và phân loại môi trường nuôi cấy vi sinh
vật
Khái niệm môi trường dinh dưỡng
Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp các chất dinh dưỡng và các chất này có
nhiệm vụ duy trì thế oxy hóa khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định của pH
trong môi trường. trong đó các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá
trình trao đổi chất nội bào.
Phân loại môi trường dinh dưỡng
o
Theo nguồn gốc
Môi trường tự nhiên: có thành phần là các sản phẩm tự nhiên như: trứng, sữa,
khoai tây, dịch chiết nấm men, đường, cám.
Môi trường tổng hợp: chứa các chất hóa học mà thành phần của chúng được
xác định và định lượng một cách cụ thể và chính xác. Ví dụ như: Czapeck, Hansen,
EMB
Môi trường bán tổng hợp: chứa cả các chất hóa học lẫn các sản phẩm tự nhiên,
ví dụ như: PGA, giá đậu đường
o
Theo trạng thái vật lý
Môi trường lỏng: thành phần môi trường này không chứa agar và thường được
sử dụng để nghiên cứu quá trình tổng hợp của vi sinh vật.
Môi trường đặc: cứ 1000ml môi trường có 15 – 20 Agar
Môi trường bán lỏng: chứa khoảng 0,3 – 0,7% agar
o
Theo công dụng
6
Môi trường phân lập
Môi trường tăng sinh
Môi trường nuôi giữ giống: nghèo dinh dưỡng
Môi trường thử nghiệm sinh hóa
2. Trình bày qui trình pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Bao gồm các bước sau:
3.
Chuẩn bị dụng cụ
Cân hóa chất
Phối chế tạo môi trường nuôi cấy
Điều chỉnh độ pH của môi trường
Phân phối môi trường vào dụng cụ
Khử trùng môi trường
Làm thạch nghiên, thạch đứng, đổ thạch vào đĩa petri
Kiển tra độ vô trùng và bảo quản
Yêu cầu của môi trường trong đĩa petri, ống nghiệm thạch nghiêng và thạch
đứng
Làm thạch nghiêng:
Cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường và môi trường chưa đông
đặc.
-
Đặt ống nghiệm có môi trường lên giá đặt nghiêng và không được
-
để môi trường chạm vào nút bông.
Để yên cho đến khi môi trường đông đặc. Yêu cầu mặt thạch phải thẳng,
nhẵn và liên tục
Làm thạch đứng:
- Đặt các ống nghiệm có môi trường là thạch đứng vào giá, để yên cho môi
trường đông đặc
Đổ môi trường vào đĩa petri:
- Toàn bộ quá trình đổ thạch vào đĩa petri được thực hiện trong tủ cấy vô
trùng và gồm các thao tác sau:
o Mở bao giấy gói các đĩa petri
7
o
o
o
o
o
o
4.
Một tay cầm dụng cụ chứa môi trường
Tay còn lại mở nút bông và hơ miệng bình trên ngọn lửa đền cồn.
Mở hé nắp đĩa petri. Nghiêng bình và rót môi trường vào đĩa petri.
Đậy nắp đĩa lại, xoay tròn đĩa để môi trường được phân phối đều bên trong đĩa.
Để yên cho môi trường đông đặc.
Lật ngược đĩa lại và bảo quản.
Giải thích tại sao không phân phối môi trường vào đĩa petri trước khi khử
trùng
Vì sẽ làm nhiễm các vi sinh vật không mong muốn, có thể nhiễm một số tạp
chất vì vậy sau quá trình nuôi cấy khó có thể xác định được kết quả. Có thể tránh được
hơi nước tiếp xúc vào môi trường nuôi cấy và vì sau khi cấy phải để yên môi trường
để cứng môi trường
5. Đĩa petri chứa môi trường trước khi cấy vi sinh vật nên úp hay ngửa? Tại
sao?
Nên để ngửa bởi vì làm kín khu vực nuôi cấy, tránh lây nhiễm các vi sinh vật
khác và cũng tránh tiếp xúc với hơi nước.
6. Ý nghĩa của việc pha chế môi trường?
Chúng ta phải pha chế môi trường cho vi sinh vật vì môi trường dinh dưỡng là hỗn
hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ duy trì thế oxy hóa- khử, áp
suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định độ pH của môi trường để vi sinh vật có thể
sinh trưởng và phát triển một cách tối ưu nhất có thể.
Làm môi trường để thực hiện việc phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật, đồng
thời để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng
7. Yêu cầu của một môi trường dinh dưỡng nuôi cấy?
Yêu cầu của môi trường dinh dưỡng: có đủ chất dinh dưỡng cần thiết, có độ pH
phù hợp. có độ nhớt nhất định, không chứa các yếu tố độc hại, hoàn toàn vô trùng,
đảm bảo sự phát triển ổn định của vi sinh vật.
8
8. Nêu ý nghĩa của các thành phần trong môi trường nuôi cấy?
Peptone chiết xuất cao thịt bò dùng làm nguồn cacbon, năng lượng và nitơ. Cao
thịt bò chứa các axit amin, peptit, nuclêôtit, axit hữu cơ, vitamin và một số chất
khoáng. Cao nấm men là nguồn phong phú các vitamin nhóm B cũng như nguồn nitơ
và cacbon.
9. Có bao nhiêu loại peptone?
Có 3 loại peptone
o Từ động vật: chiết xuất từ thịt, cao thịt bò, dịch thuỷ phân một phần của thịt bò,
cazêin,… dùng làm nguồn cacbon, năng lượng và nitơ. Cao thịt bò chứa các
axit amin, peptit, nuclêôtit, axit hữu cơ, vitamin và một số chất khoáng.
o Từ thực vật: chiết xuất từ đậu nành,….
o Nấm men: cao nấm men, Cao nấm men là nguồn phong phú các vitamin nhóm
B cũng như nguồn nitơ và cacbon).
10. Cơ chế làm trong nước của lòng trắng trứng
Cách làm trong nước bằng lòng trắng trứng: lòng trắng trứng: nước tỉ lệ 1:1→
đánh tan nổi bọt → cho vào 1 lít môi trường → đun sôi khoảng 5 phút → để nguội
→ lắng cặn →lọc.
Cơ chế: các protein trong lòng trắng trứng như albumin, ovalbumin dưới tác động
của sự khuấy trộn và gia nhiệt bị biến tính không thuận nghịch, các liên kết trong
protein được kéo dãn làm lộ ra nhiều nhóm chức → hình thành lực hút tĩnh điện với
các ion, bụi bẩn có trong nước → sau khi lắng, lọc nước trong hơn.
9
BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT
PHÂN LẬP SINH VẬT
I.
cứu.
2.
Nguyên tắc
1. Mục đích của việc nuôi cấy
Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các nguyên liệu vật phẩm cần nghiên
Tiến hành việc phân giống các vi sinh vật một cách nhanh chóng.
Bảo tồn các giống vi sinh vật thuần khiết.
Nghiên cứu các đặc tính sinh học và sự phát triển từng loại của vi sinh vật.
Nguyên tắc nuôi cấy vi sinh vật
Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh tạp
nhiễm các vi sinh vật không mong muốn từ môi trường ngoài.
Môi trường và dụng cụ nuôi cấy đều phải khử trùng triệt để. Duy trì tốt các điều
kiện nuôi cấy để vi sinh vật phát triển thuận lợi.
II. Dụng cụ, môi trường và hóa chất
III.
Tiến hành thí nghiệm
1. Phương pháp cấy truyền thạch (môi trường thạch).
1.1.
Cấy truyền trên thạch đĩa
Có thể cấy trên đĩa pêtri theo 1 trong 2 cách sau:
* Dùng que cấy đầu tròn và thực hiện theo trình tự sau:
- Để đĩa pêtri lên bàn.
- Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật theo thứ tự và yêu cầu ở
phương pháp chung.
- Tay trái hé mở nắp đĩa pêtri vừa đủ để cho que cấy vào.
- Nhẹ nhàng và nhanh chóng lướt que cấy lên mặt thạch theo một
trong các kiểu sau:
+ Theo hình chữ chi trên toàn bộ mặt thạch (hình 3.3a)
+ Theo những đường song song (hình 3.3b)
+ Theo 4 hình chữ chi 4 góc (hình 3.3c)
Hình 3.1 Các kiểu cấy trên thạch đĩa
10
Hình 3.2:
Cách
dàn vi sinh vật
lên bề
mặt môi trường
A – que gạt B – dàn bằng que gạt; C: Sự sinh trưởng của VSV sau khi dàn đều
bằng que gạt; D : Sự sinh trưởng của VSV sau khi dàn bằng que cấy
1.2.
Phương pháp cấy trên thạch nghiêng
- Phương pháp này dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí.
- Sử dụng que cấy đầu tròn tiến hành các thao tác theo đúng trình tự nói trên
- Thực hiện việc cấy giống vào ống thạch nghiêng bằng các thao tác tiếp
theo:
+ Hoà giống ở đầu que cấy vào giọt nước ở đáy ống nghiệm.
+ Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu (hình 3.1)
-
Hình chữ chi
Hình vòng xoắn
Hình vạch ngang song song
d
11
Hình 3.2: Một số kiểu cấy trên ống thạch nghiêng
1.3. Phương pháp cấy trên thạch đứng: cấy sinh vật kị khí
Sử dụng que cấy hình kim
Sau khi lấy giống vi sinh vật, dùng que cấy này đâm sâu vào phần khối thạch
hình trụ.
Đâm sát đáy ống nghiệm và đâm thành 3 đường: 1 đường chính giữa, 2 đường
sát thành ống tuỳ yêu cầu.
Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gây nứt, vỡ môi trường
IV. Trả lời câu hỏi.
1.
Các phương pháp gieo cấy vi sinh vật
- Cấy truyên vi sinh vật trên môi trường lỏng: cấy truyền bằng pipette Pasteur,
cấy truyền bằng que cấy vòng.
- Cấy truyền trên môi trường lỏng: cấy truyền trên ống truyền thạch nghiêng,
trên ống nghiệm thạch đứng, cấy truyền trên thạch đĩa.
2. Các phương pháp giữ ống vi sinh vật
a. Phương pháp cấy truyền định kỳ trên môi trường mới
Ưu điểm: phương pháp này đơn giản, dễ làm, thời gian bảo quản không lâu.
Nhược điểm: tốn môi trường, công sức và thời gian. Dễ bị tạp nhiễm và dễ dẫn đến
mất chủng giống gốc. Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữa các chủng trong quá trình bảo
quản. Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp cho các chủng bảo
quản. Giống gốc có thể bị mất do sai sót khi dùng môi trường cấy truyền không thích
hợp. Chủng vi sinh vật đễ bị thay đổi các đặc tính sinh học do đột biến xuất hiện sau
mỗi làn cấy truyền.
b. Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng
Ưu điểm: đơn giản nhưng hiệu quả cao nhờ khả năng làm chậm quá trình biến
dưỡng và hô hấp nên vi sinh vật phát triển chậm lại. Môi trường không bị mất nước và
khô.
c. Phương pháp giữ giống trên đất, cát, hạt…
Ưu điểm: dễ bảo quản các chủng bào tử tiềm sinh, thời gian bảo quản có thể kéo
dài đến 1 năm.
Nhược điểm: khử trùng môi trường trước
12
d. Phương pháp lạnh đông
Ưu điểm: nhanh, thuận lợi cho việc bảo quản một số lượng lớn mẫu. vi sinh vật
được bảo quản từ 10-20 năm, tiết kiệm công sứcvà sai sót nhãn mác, tạp nhiễm.
Nhược điểm: giá thành thiết bị, độ ổn định của các chủng vi sinh vật bảo quản theo
các đợt bảo quản là khác nhau. Trước khi đem ra sử dụng phải được hoạt hoá trên môi
trường thích hợp một số lần để đảm bảo phục hồi các đặc tính sinh học của chủng vi
sinh vật.
e. Phương pháp bảo quản lạnh sâu
Ưu điểm: thích hợp cho nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm men, vi
khuẩn, nấm mốc, vỉut, tảo và các dòng tế bào động vật. thời gian bảo quản lâu.
Nhược điểm: đầu tư kinh phí cho thiết bị, điện quá cao, rủi ro cháy nổ, không thích
hợp cho các chủng vi sinh vật hay dùng đến thường xuyên.
3. Trình bày nguyên tắc và mục đích của quá trình phân lập.
- Nguyên tắc: tách rời các tế bào vi sinh vật, nuôi cấy các tế bào trong môi
trường dinh dưỡng để tạo khuẩn lạc riêng rẽ.
- Mục đích: phân tách các chủng vi sinh vật trong môi trường tự nhiên và cô lập
chúng nhằm chọn lựa giống vi sinh vật thuần khiết cho những mục đích khác nhau.
4. Muốn phân lập nấm men, nấm mốc, vi khuẩn thì nguồn mẫu cần chọn là
gì?
Trả lời:
- Phân lập vi khuẩn: nguồn mẫu là cỏ khô cắt nhỏ.
- Nấm mốc: nguồn mẫu là cơm nguội, xôi làm mốc tương, bánh mì để khô
- Nấm men: nguồn mẫu là bề mặt trái cây, dịch ép như táo, lê hoặc trong rượu
nếp, bia, nước mía.
5. So sánh sự giống và khác nhau của cách phân lập vi sinh vật hiếu khí và kị
khí.
Trả lời:
- Giống nhau: nhằm phân tách các chủng vi sinh vật trong môi trường tự nhiên
và cô lập chúng nhằm chọn lựa những giống vi sinh vật thuần khiết.Khác nhau:
Phân lập vi sinh vật hiếu khí
- Hút dịch mẫu đã pha loãng cho
vao dĩa petri có môi trường thích
Phân lập vi sinh vật kị khí
- Dùng môi trường đặc trong ống nghiệm đem
chưng cách thủy để loại bỏ không khí.
13
hợp.
- Dùng que gạt thủy tinh phân phối
- Để nguội môi trường còn 45-50oC
- Hút dịch nghiên cứu cho vào ống môi trường, đậy
dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch.
- Tiếp tục dùng que gạt mẫu cho
nút lại, lắc tròn quanh trục ống nghiệm.
- Rút nhanh, đậy nhanh tránh cho ống nghiệm có
đều khắp mặt thạch đĩa thứ 2 rồi
không khí.
- Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 đĩa
đĩa thứ 3.
- Ủ ấm ở nhiệt độ thích hợp sau
một thời gian nhất định ta sẽ nhận
được các khuẩn lạc riêng rẽ từ các
đĩa thứ 2, 3
petri và ủ ở nhiệt độ thích hợp
- Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc
riêng rẽ trong môi trường, dùng que cấy cắt cả khối
môi trường rồi cấy vào môi trường lỏng thích hợp.
6. Tại sao khi đi cân hoá chất chỉ cần 2-3 người?
Do dụng cụ trong phòng hoá chất có hạn, đi cân hoá chất cần 2-3 người đã đảm
bảo về thời gian,hiệu quả làm việc
14
BÀI 4: PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT KÍNH HIỂN VI BẰNG KÍNH
HIỂN VI QUANG HỌC
1. Trình bày cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của kính hiển vi quang học
a. Cấu tạo
Kính hiển vi quang học gồm có hai phần:
- Hệ thống cơ học: giá kính gồm có chân kính, thân kính, trụ đỡ và xoay thị kính,
ổ gắn và xoay vật kính, bán kính, thanh trượt di chuyển tiêu bản, ốc di chuyển thanh
trượt, kẹp giữ tiêu bản, ốc di chuyển tụ quang kính, ốc điều chỉnh thô sơ cấp, ốc điều
chỉnh thứ cấp (vi cấp).
- Hệ thống quang học gồm: thị kính, vật kính, tụ quang kính, màng chắn sáng,
nguồn chiếu sáng (đèn điện chiếu sáng hoặc kính chiếu sáng). Ngoài ra, ở kính dùng
nguồn chiếu sáng là đèn điện thì có thêm bộ phận cung cấp điện như phích cắm, dây
điện, cầu chì, mạch điện (trong chân kính) và nút điều chỉnh cường độ chiếu sáng.
b. Nguyên tắc hoạt động
Vật kính là hệ thống quang học phức tạp gồm một số thấu kính, trực tiếp phóng đại
mẫu vật. Các thấu kính sắp xếp theo thứ tự, thấu kính nhỏ ngoài cùng hướng vào tiêu
bản có độ phóng đại lớn nhất. Độ phóng đại của kính phụ thuộc vào tiêu cự, tức bán
kính cong của thấu kính. Thấu kính càng cong, tiêu cự càng ngắn thì khả năng phóng
đại càng lớn.
Có hai loại vật kính
Vật kính khô độ phóng đại nhỏ như x4,x10,x15,x40.
Vật kính dầu có độ phóng đại lớn như x90,x100.
Thị kính cũng có độ phóng đại phức tạp, gồm hai thấu kính, một hướng về phía
mắt người xem, một hướng về vật kính. Thị kính phóng đại một lần nữa ảnh do vật
kính thu vào, làm ảnh to lên, xem rõ hơn.
Độ phóng đại của kính = Độ phóng đại của vật kính x độ phóng đại của thị kính.
Ví dụ: Độ phóng đại của vật kính x100, độ phóng đại của thị kính x10. Như vậy độ
phóng đại của kính : 100x10=1000 lần.
15
Năng suất phân ly của kính quan trọng hơn độ phóng đại, và là tiêu chuẩn chính để
chọn kính hiển vi.
2. Có bao nhiêu loại kính hiển vi? Đặc điểm của từng loại?
Có 5 loại kính hiển vi.
-
Kính hiển vi viền đen
Ánh sáng thường chiếu từ dưới lên, qua rìa của tụ quang nền đen, chiếu hắt vào
xung quanh tiêu bản, những tia sáng này bị tiêu bản làm khúc xạ rồi đưa vào vật kính.
Tiêu bản được soi sáng rực trên nền đen, giống như trong phòng tối có một tia sáng
chiếu vào, giúp ta thấy rõ từng hạt bụi trong không khí bị tia sáng chiếu vào. Chức
năng: quan sát hình thái và đặc tính của một số vi khuẩn mà kính hiển vi thường khó
quan sát.
-
Kính hiển vi đổi pha
Ánh sáng thường bị đổi pha và biên độ dao động bởi cấu trúc đặc biệt của tụ quang
kính, vật kính và thị kính. Chức năng: dùng quan sát rõ nét các cấu trúc nhỏ như tiên
mao, các lớp màng.
-
Kính hiển vi huỳnh quang
Chùm tia tử ngoại chiếu vào các tiêu bản đã nhuộm màu bằng các chất huỳnh
quang. Trong tế bào, các cấu trúc khác nhau sẽ phát quang với màu sắc khác nhau.
Chức năng: quan sát và phân biệt các cấu trúc khác nhau trong tế bào vi sinh vật.
-
Kính hiển vi điện tử
Chùm tia điện tử bước sóng rất ngắn, năng suất phân li rất lớn nên độ phân giải
cao, giúp phân biệt hai điểm rất gần nhau. Chức năng: quan sát vỉut, cấu trúc phân tử
của tế bào.
-
Kính hiển vi quang học
16
Dùng bước sóng 500 nm – 560 nm trong chùm ánh sáng thường để tạo năng suất
phân li lớn giúp phân biệt hai điểm cách nhau khoảng 0.2 µm trở lên. Hệ thống phóng
to của kính hiển vi quang học gồm hai bộ phận: vật kính và thị kính. Mỗi bộ phận là
một hệ thống thấu kính hội tụ phức tạp. Chức năng của kính hiển vi quang học là dùng
để quan sát tế bào vi sinh vật, kí sinh trùng, tế bào động vật, thực vật.
3. Tại sao khi quan sát ở vật kính × 100 phải cho 1 giọt dầu soi kính?
Do chiết suất ánh sáng của không khí nhỏ hơn thuỷ tinh, nên tia sáng khi đi qua
tiêu bản thuỷ tinh sẽ bị khúc xạ một phần. Phần phía ngoài cuả tia sáng do bị khúc xạ
nên không đi vào được vật kính. Vật kính có độ phóng đại càng lớn thì đường kính
của thấu kính càng nhỏ, lượng tia sáng đi vào vật kính rất ít nên không nhìn rõ ảnh.
Để hạn chế nhược điểm này ta dùng dầu soi kính có chiết suất ánh sáng gần bằng
thuỷ tinh. Thuỷ tinh và dầu soi được xem là một môi trường đồng nhất. ánh sáng đi
qua không bị khúc xạ nên tập trung đầy đủ vào vật kính, giúp xem rõ ảnh.
BÀI 5. PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MÀU VI SINH VẬT
17
Báo cáo thực tập
1. Sau khi nhuộm, vi khuẩn Gram dương có màu xanh đen hay tím, Gram âm
có màu đỏ vàng hay đỏ tía. Giải thích nguyên nhân?
Sau khi nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương sẽ có màu xanh đen hay tím, còn vi
khuẩn Gram âm có màu đỏ vang (nhuộm safranin O) hay đỏ tía (Fuchsin Ziehl). Sở dĩ
có màu như vậy là do vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm có sự khác biệt về
thành phần hóa sinh của thành tế bào vi khuẩn. Thành tế bào vi khuẩn Gram dương thì
có nhiều peptidoglycan (phức chất protein-đường) và các peptidoglycan này được liên
kết chặt chẽ với nhau từ đó có thể giúp cho tế bào kháng lại chất tẩy màu nên sau khi
rửa bằng cồn thì crystal violet không bị rửa trôi và vẫn giữ được màu tím, sau đó
nhuộm bổ sung bằng dung dịch safranin O hoặc Fuchsin Ziehl, nhưng không có sự
thay đổi màu nhiều. Thành tế bào vi khuẩn Gram âm có thành phần lipid ở nồng độ
cao cho nên chúng có thể hòa tan trong chất khử màu (aceton, alcohol,…) và bị rửa
trôi cùng với crystal violet (màu tím), sau khi nhỏ dung dịch tẩy màu, ta nhuộm them
bằng dung dịch safranin O hoặc Fuchsin Ziehl, lúc này vi khuẩn Gram âm có màu đỏ
vàng hay đỏ tía.
2. Nếu không nhuộm bổ sung thuốc thử safranin hoặc fuchsin, vi khuẩn
Gram âm có màu gì? Tại sao?
Nếu không nhuộm bổ sung thuốc thử safranin hoặc fuchsin, vi khuẩn Gram âm sẽ
không có màu. Bởi vì ở giai đoạn tẩy màu bằng cồn đã rửa trôi crystal violet (có màu
tím) nên sau giai đoạn tẩy màu vi khuẩn Gram âm đã bị mất màu của crystal violet
được nhuộm ở trước đó. Hoặc trường hợp vi khuẩn Gram âm sẽ có màu tím cũng có
thể ở giai đoạn tẩy rửa, ta không tẩy màu cho đến khi giọt dung dịch cuối cùng chảy ra
khỏi phiến kính là không màu.
BÀI 6. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT
18
1. Trình bày nguyên tắc và phương pháp phân lập vi khuẩn thuần khiết?
Nguyên tắc:
- Gieo cấy vi khuẩn đã pha loãng trên môi trường dinh dưỡng đặc trưng (2%
thạch hay còn gọi là agar).
- Nuôi dưỡng trong điều kiện thích hợp cho mọc các khuẩn lạc tách biệt nhau.
- Cấy tách từ khuẩn lạc mọc tách biệt sang ống môi trường dinh dưỡng thạch
nghiêng để thu nhận chủng vi khuẩn thuần khiết.
Phương pháp phân lập vi khuẩn thuần khiết:
1.1.
Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn các vi sinh vật hiếu khí:
Có nhiều kỹ thuật ria khác nhau để thực hiện hộp ria và tạo khuẩn lạc đơn. Một số
kỹ thuật ria thường dùng: kỹ thuật ria chữ T , kỹ thuật ria bốn góc ,kỹ thuật ria tia ,kỹ
thuật ria liên tục
Thao tác kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn được thực hiện như sau:
a. Kỹ thuật hộp ria:
-
Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng thu giống.
-
Ria các đường trên đĩa pêtri chứa môi trường thích hợp (ria chữ T và ria bốn
góc). Sau mỗi đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy và làm nguội trước khithực hiện
đường ria tiếp theo.
-
Bao gói đĩa pêtri, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm.
b. Kỹ thuật hộp trải:
-
Dùng pipetman và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1 ml dịch chứa
giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa pêtri.
-
Nhúng đầu thanh gạt (que trải) thuỷ tinh vào cồn 70 0, hơ qua ngọn lửa để khử
trùng. Để đầu thanh gạt nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa.
-
Mở đĩa pêtri, đặt nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri.
- Dùng đầu thanh gạt xoay, trải đều dịch giống lên bề mặt thạch. Trong khi trải,
thực hiện xoay đĩa một vài lần, mỗi lần khoảng 1/2 chu vi đĩa tạo điều kiện cho thanh
gạt trải dịch giống đều khắp bề mặt môi trường.
19
- Rút thanh gạt khỏi đĩa, đậy đĩa, gói và ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong
tủ ấm.
c. Kỹ thuật hộp đổ:
-
Dùng pipetman và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 1 m dịch chứa
giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa pêtri.
-
Đổ khoảng 15 - 20 ml môi trường đã đun chảy và để nguộ đến 45 - 55 0C vào
đĩa petri đã cấy mẫu.
-
Xoay nhẹ đia petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để dung
dịch giống được trộn đều trong môi trường cấy.
-
Đậy nắp đĩa pêtri, để đông tự nhiên.
1.2.
-
Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn các vi sinh vật hiếu khí:
Dùng môi trường đặc trong ống nghiệm đem chưng cách thuỷ để loại bỏ không
khí trong môi trường.
-
Để nguội môi trường còn 45 - 500C.
-
Hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống môi trường, đậy nút lại, lắc tròn quanh
trục ống nghiệm.
-
Rót nhanh môi trường ở ống nghiệm vào nắp dưới của đĩa pêtri và đậy thật
nhanh nắp trên lại, sao cho giữa mặt nắp và môi trường không còn không khí.
- Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 nắp của đĩa petri và ủ ở nhiệt độ
thích hợp.
- Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trong khối môi
trường, dùng que cấy cắt cả khối môi trường rồi cấy vào môi trường lỏng thích hợp.
2. Nguyên tắc của việc nuôi tích lũy?
Nguyên tắc của việc nuôi tích lũy: trường hợp số vi khuẩn có trong mẫu ít thì
phải nuôi tích lũy bằng cách ủ mẫu, bổ sung chất dinh dưỡng và các điều kiện lý hóa
cần thiết hoặc bổ sung các chất ức chế sinh trưởng của các vi sinh vật đi kèm.
20