Công nghệ sản xuất fruitose syrup

MỤC LỤC
I. TỔNG QUAN
1.1. High fructose corn syrup (HFCS)
1.1.1. High fructose corn syrup (HFCS)
1.1.2. Tình hình sản xuất và sử dụng high fructose corn syrup
1.2. Glusose isomerase
1.2.1. Định nghĩa enzyme
1.2.1. Sơ lược enzyme glucose isomerase (GI)
1.2.2. Phản ứng đồng phân hóa
1.2.3. Động học phản ứng đồng phân hóa glucose thành fructose
1.3. Streptomyces flavogrieus
1.3.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc Streptomyces spp.
1.3.1.1. Cấu trúc tế bào và trao đổi chất
1.3.1.2. Đặc điểm của Steptomyces
1.3.2. Phân lập Streptomyces flavogrieus
1.3.3. Chiết xuất enzyme glucose isomerase
1.3.4. Xác định hoạt tính glucose isomerase
II. CỐ ĐỊNH ENZYME GLUCOSE ISOMERASE
2.1. Đặc điểm của enzyme cố định
2.2. Các phương pháp cố định enzyme
2.3. Cố định enzyme glucose isomerase trên xilochrom B
III. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT HFCS
3.1. So đồ chuyển hóa tinh bột thành siro fuctose.
3. 2.Thiết bị.

I. TỒNG QUAN
1.1. High fructose corn syrup (HFCS)
1.1.1. High fructose corn syrup (HFCS)
HFCS được gọi là isoglucose ở Anh và glucose-fructose ở Canada, và lần đầu tiên
được giới thiệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và nước giải khát trong cuối những
năm 1960 (HFCS-42 vào năm 1967) và 1970 (HFCS-55 năm 1977) để cải thiện sự ổn
định và chức năng khác nhau của thực phẩm và đồ uống. Chất làm ngọt Carbohydrate
được sử dụng bởi vì nó tăng cường hương vị các loại thực phẩm khác nhau. Nó chủ yếu
là monosaccharides như glucose, fructose, galactose và disaccharides như sucrose,
lactose, maltose. Người ta tìm kiếm chất ngọt thay thế succrose và không nhiều calo để
đảm bảo sức khỏe cho bệnh nhân tiểu đường, đồng thời kiểm soát cân nặng. Để sản xuất
của HFCS tương đối ít kinh phí đã làm cho nó có thể trở thành một giải pháp thay thế
hữu hiệu đối với sucrose và đường tự nhiên khác.
Hiện chủ yếu người ta sản xuất hỗn hợp glucose (52%) và fructose (42%) từ tinh bột
ngô với sản lượng hàng năm khoảng 10 triệu tấn sirô fructose HFCS (high-fructose corn
syrup). Điều này càng trở nên thuận tiện hơn khi sử dụng glucose isomerase cố định sử
dụng được nhiều lần (Nguyễn Tiến Thắng, 2010).
Marshall và Kooi (1957) đã phát triển quy trình sản xuất high fructose corn syrup
(HFCS). Ba loại HFCS được sử dụng phổ biến: HFCS-90 (90% fructose và glucose 10%)
được sử dụng trong các ứng dụng chuyên biệt, nhưng quan trọng hơn hỗn hợp glucose
syrup: HFCS-42 (42% fructose và glucose 58%) và HFCS-55 (55% fructose và glucose
45%).
1.1.2. Tình hình sản xuất và sử dụng high fructose corn syrup
HFCS được sản xuất chủ yếu từ ngô. Ngô được ngâm để làm mềm hạt cứng, tiếp theo
xay ướt và tách thành tinh bột ngô (từ nội nhũ); vỏ ngô, protein và dầu (từ mầm). Tinh
bột ngô bao gồm các phân tử đường dài, bao gồm amylose và amylopectin và cần gia
nhiệt hoặc thêm HCl cộng với hoạt động của ba loại enzyme khác nhau để phá vỡ nó
thành đường glucose đơn giản và đường fructose trong HFCS. Một loại enzyme công
nghiệp α-amylase sản xuất từ vi khuẩn Bacillus spp, thủy phân tinh bột ngô thành chuỗi

ngắn dextrin và oligosaccharides. Một loại enzym thứ hai, glucoamylase (còn gọi là
amyloglucosidase), được sản xuất từ nấm như Apergillus, phá vỡ dextrin và
oligosaccharides thành đường đơn glucose. Các sản phẩm của hai loại enzyme là glucose
syrup. Enzyme thứ ba và tương đối đắt tiền được sử dụng trong quá trình này là glucose
isomerase (còn gọi là D-glucose ketoisomerase ketolisomerase D-xylose), có thể chuyển
đổi giữa glucose với fructose. Α-amylase và glucoamylase được sử dụng chỉ một lần,
glucose isomerase được tái sử dụng cho đến khi nó mất đi hầu hết các hoạt động enzyme
của nó. α-amylase và glucoamylase được sử dụng tạo ra HFCS đã được biến đổi để cải
thiện sự ổn định nhiệt trong việc sản xuất HFCS
Sau khi tinh sạch và loại bỏ tạp chất, HFCS-90 được trộn với glucose syrup để sản
xuất HFCS-55 (55% fructose) và HFCS-42 (42% fructose). Cả hai HFCS-55 và HFCS-42
có nhiều ưu điểm về chức năng giống nhau, nhưng mỗi loại có đặt tính đăc biệt làm cho
nó phù hợp với các loại thực phẩm cụ thể.Vì hàm lượng fructose cao, HFCS-55 ngọt hơn
đường sucrose và do đó được sử dụng rộng rãi như là chất tạo ngọt trong nước trái cây,
và các đồ uống có gas. HFCS-42 có một vị ngọt nhẹ và không làm ẩn đi những hương vị
tự nhiên của thực phẩm.Vì vậy, nó được sử dụng rộng rãi trong trái cây đóng hộp, nước
sốt, súp, gia vị, bánh nướng, và nhiều loại thực phẩm chế biến khác. Nó cũng được sử
dụng rất nhiều trong ngành công nghiệp sữa như sữa chua, sữa hương vị, kem, và món
tráng miệng đông lạnh khác.Việc sử dụng HFCS đã tăng lên kể từ khi được giới thiệu
như là một chất làm ngọt.
HFCS tương đối rẻ, ngọt hơn succose, hòa tan trong dung dịch tốt. HFCS là chất lỏng
và do đó dễ dàng vận chuyển và sử dụng trong các công thức đồ uống nhẹ (Hanover và
White, 1993).Nó cũng có tính axit , có khả năng bảo quản nên làm giảm việc sử dụng các
chất bảo quản khác.
1.2. Glusose isomerase
1.2.1. Định nghĩa enzyme
1.2.1.1. Định nghĩa:
Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất. Sự trao đổi
chất mà ngừng lại thì sự sống sẽ không còn tồn tại. Quá trình trao đổi của một chất là tập

hợp của rất nhiều các phản ứng hóa học phức tạp. Enzyme là hợp chất protein xúc tác cho
các phản ứng hóa học đó. Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất
định và đảm bảo cho các phản ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp
nhàng trong cơ thể sống.
Enzyme có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống. Chính do những tác nhân
xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme còn được gọi là các chất xúc tác sinh học
(biocatalysators) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học.
Chúng là chất xúc tác sinh học không chỉ có vai trò quan trọng trong quá trình sinh
trưởng, phát triển của mọi sinh vật mà nó còn giữ vai trò rất quan trọng trong các lĩnh vực
khác như: công nghệ chế biến thực phẩm, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen
vào bảo vệ môi trường, đặc biệt là trong y học với ứng dụng sản xuất dược phẩm.
1.2.1.2. Cơ chế xúc tác enzyme:
Cơ chế xúc tác enzyme thường trải qua ba giai đoạn theo sơ đồ sau:
E + S → ES → P + E
Trong đó: E là enzyme, S là cơ chất (Substrate), ES là phức hợp enzyme – cơ chất,
P là sản phẩm (Product).

Hình. Chức năng của enzyme. Sư tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất
và chuyển hóa phức hợp thành sản phẩm (Prescott, Harley và Klein, 2005).

– Giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức
hợp enzyme – cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi năng
lượng họa thóa thấp.
– Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các
liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng.
– Giai đoạn thứ ba: tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng ra dưới dạng
tự do.
Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức hợp ES là tương
tác tỉnh điện, liên kết hydro, tương tác Van det Waals. Mỗi loại liên kết đòi hỏi những
điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước.
1.2.1. Sơ lược enzyme glucose isomerase (GI)
D-Glucose/xylose isomerase (D-xylose isomerase ketol; EC 5.3.1.5), thường được gọi
là glucose isomerase (GI), một trong ba enzym có giá trị cao nhất, rồi đến amylase và
protease. Theo Wiseman, GI có thể là quan trọng nhất trong tất cả các enzyme công
nghiệp trong tương lai. Nó xúc tác đồng phân hóa thuận nghịch D-glucose và D-xylose
thành D-fructose và D-xylulose. Sự chuyển đổi xylose thành xylulose phục vụ một nhu
cầu dinh dưỡng của vi khuẩn hoại sinh phát triển mạnh trên cây mục nát và cũng hỗ trợ
trong chuyển hóa sinh học của hemicellulose để sản xuất ethanol. Đồng phân hóa glucose
thành fructose có tầm quan trọng thương mại trong việc sản xuất HFCS. Sucrose có
nguồn gốc từ củ cải đường (40%) và mía (60%) là các chất làm ngọt chính trên thế giới
cho đến năm 1976. Việc sản xuất HFCS bằng cách sử dụng isomerase glucose được phát
triển đầu tiên ở Nhật Bản và sau đó tại Hoa Kỳ.
Nguồn gốc của phát triển thành công ngày hôm nay của sản phẩm fructose syrup nằm
trong sự phát hiện của enzyme glucose-isomerizing. Việc phát hiện của Marshall và Kooi
năm 1957 về khả năng của enzyme glucose-isomerase từ Pseudomonas hydrophila là
điểm khởi đầu của khai thác các enzyme này để sản xuất HFCS như một sự thay thế cho
đường mía. Mặc dù ái lực của enzyme này cho glucose là thấp hơn 160 lần so với xylose,
nhưng các enzym cũng có giá trị thương mại đáng kể. Takasaki và Tanabe đã phân lập từ
Bacillus megaterium AI một glucose isomerase (EC 5.3.1.18). Một hoạt động tương tự

như glucose isomerase, xúc tác các đồng phân hóa của cả hai glucose và mannose
fructose, được phân lập từ Paracolobacterium aerogenoides. Glucose isomerase sản xuất
bởi vi khuẩn axit Heterolactic yêu cầu xylose như một chất cảm ứng và tương đối ổn
định ở nhiệt độ cao. Với nhiệt ổn định và không không yêu cầu cofactors đắt tiền như
NAD1 hoặc ATP cho hoạt động. Tiềm năng cho việc sử dụng thay thế đường sản xuất từ
tinh bột đã được đề xuất. Các chế phẩm enzyme dùng đồng phân hóa glucose lần đầu tiên
được thực hiện trên một quy mô công nghiệp vào năm 1967. Nhu cầu đối với HFCS
trong ngành công nghiệp thực phẩm gia tăng, và đến năm 1980, thực tế tất cả các công ty
lớn chế biến tinh bột trong giới phương Tây đã phải dùng đến công nghệ GI. Ngày nay,
enzyme chiếm lĩnh thị trường lớn nhất trong ngành công nghiệp thực phẩm.

Hình. Cấu trúc không gian của GI
Enzyme so với đồng phân hóa trong hóa học. Việc chuyển đổi hóa học của glucose
thành fructose đã được biết đến từ 100 năm qua và tạo thành một trong 1 nhóm phản ứng
Những phản ứng này thường được thực ở pH và nhiệt độ cao. Khả năng sản xuất fructose

hóa học từ glucose đã được nghiên cứu bởi Barker et al.. Phản ứng này là không đặc hiệu
và dẫn đến hình thành các đường nonmetabolizable như psicose và các sản phẩm màu
không mong muốn khác. khó khăn để đạt được một fructose nồng độ hơn 40% theo
phương pháp này. Hơn nữa, hóa học sản xuất fructose có hương vị và vị ngọt giảm,
không thể dễ dàng khắc phục. Do đó, nó không thể được sử dụng thương mại. Mặt khác,
enzyme chuyển đổi glucose thành fructose có nhiều ưu điểm, chẳng hạn như đặc trưng
của phản ứng, yêu cầu các điều kiện pH và nhiệt độ của môi trường xung quanh của, và
không hình thành các sản phẩm phụ. Vì vậy, enzyme chuyển đổi đồng phân hóa hóa học
của glucose thành fructose, và ngày nay đã có các quá trình liên quan đến GI đáng kể
trong việc mở rộng thị trường công nghiệp.
Glucose isomerase chủ yếu được thu nhận từ vi khuẩn. Ứng dụng của enzyme này
trong sản xuất công nghiệp được bắt đầu từ khi áp dụng công nghệ sử dụng enzyme
glucose isomerase cố định trên chất mang không tan.
Glucose

isomerase từ Lactobacillus sp. cần có mặt Co2+ và Mg2+ để hoạt hóa.

Glucose isomerase từ Streptomeces có pH optimum 8,0 – 8,5, MW 165.000 – 180.000
Da, ổn định trong khoảng pH 5,0 – 11,0. Glucose isomerase từ Bacillus coagulans do
hang Novo cung cấp có thể hoạt động ở 90 oC, nhưng bền hơn cả là ở 60 – 65 oC, pH
optimum 8,0 – 8,5. Một số sản phẩm glucose isomerase thương mại trình bày trong bảng
(Nguyễn Tiến Thắng, 2010)
Tên thương mại
GODO - GI
Taka - Sweet
Spezyme GI
Optisweet
G-zyme G 993
Swetase
Sweetzyme
Glucoisomerase

Nhà sản xuất
Godo Shusei [GO]
Solvey Enzyme [SOE]
Cultor Ltd. [CL]
Solvey Enzyme [SO]
CPC International/Div
Enzyme Biosystems [CPC]
Roquette Freres S.A [RF]
Nagase Co. Ltd [NG]
Novo Nordisk A/S [NO]
Biological Products [ICI]

1.2.2. Phản ứng đồng phân hóa

Nguồn gốc
S. griseofuscus
S. olivaceus
A. rubiginosus
S. olivochromo
S. violacenoniger
S.phaeochromo
Bacilluscoagu
Arthrobacter sp.

Các thí nghiệm được thực hiện trong bình phản ứng sinh học. Chất xúc tác là
Sweetzyme IT với kích thước hạt từ 0,4 – 1,0 mm, được cung cấp bởi Novozyme A/S
(Bagsvaerd, Denmark). Sweetzyme IT là một cấu trúc xốp mang enzyme cố định glucose
isomerase.
Một trong những cơ chế động học được xúc tác bởi enzyme glucose isomerase là cơ
chế thuận nghịch Briggs-Haldane với k là giá trị hằng số không đổi (A. Converti, M. Del
Borghi, 1997)
G+E

k1

k-1

GE

k2

F+E

k- 2

Toàn bộ phản ứng đồng phân hoá glucose dựa trên cơ chế thuận nghịch BriggsHaldane thì được mô tả như sau:

Với hằng số Km và thể tích lớn nhất được tính theo phản tứng theo phản ứng
thuận nghịch:

Hệ số cân bằng được tính trong một phản ứng enzyme thuận hoặc nghịch:

Tham số động học của toàn bộ phản ứng có thể tính được bằng phương pháp
Lineweaver-Burk.
Dung dịch glucose và fructose được chuẩn bị với nồng độ 0.5; 1.0; 2.0 và 3.0
mol/L. Thêm vào 20 g/L dung dịch thuốc thử heptahydrated maige sulphate

(MgSO4.7H2O) để dung dịch hoạt động và bền. Đầu tiên, tất cả các dung dịch phải
được loại khí, tối thiểu 2h để đảm bảo khí hoà tan sẽ không gây ảnh hưởng đến
phản ứng.Sử dụng 0.05 mol/L dung dịch đệm Tris để giữ pH của dung dịch ở mức
7.7 – 7.8.
Thêm vào 60 mL dung dịch thuốc thử và 1 g Sweet-zyme IT cho mỗi thử
nghiệm. Bình phản ứng được khuấy ở 150 rpm và nhiệt độ 328 K. Khoảng 50 μ
L sẽ được lấy ra từ bình phản ứng tương ứng ở các khoảng thời gian đặc trưng và
được pha loãng ở các khoảng nồng độ trong một bộ cảm biến RI. Dung dịch
glucose và fructose sẽ được xác định bằng phương pháp cột sắc ký lỏng cao áp, sủ
dụng bộ cảm biến RI.
Tham số động học nhận được được trình bày ở bảng 2. Gía trị hệ số cân bằng
Kc, xác định khả năng tạo sản phẩm fructose dưới điều kiện thử nghiệm được sử
dụng. Ở bảng 2, có thể một vài tham số động học của phản ứng đồng phân quang
học glucose đã được đưa ra.
Trong lò phản ứng, khối lượng cân chính xác được biểu diễn trong giới hạn cho
phép của sự chuyển hoá:

(17)
Với W là khối lượng xúc tác trong bình phản ứng và X là thuốc thử chuyển hoá.
Tham số φ là:

Từ việc áp dụng biểu đồ phương pháp Linewaever-Bruck, xác định nồng độ
trong thử nghiệm ban đầu là một hàm số theo thời gian. Công thức (17) được dùng
để xác định tham số của tất cả các điểm của đường cong thử nghiệm. Phương pháp
hồi quy tuyến tính được đưa ra, chỉ rõ hàm số của công thức (17), toàn bộ phương
trình hồi quy không những xác định giá trị của tham số mà còn cho biết giá trị tổng
nhỏ nhất của phần còn lại để từ đó thiết lập dữ liệu cho các thử nghiệm. Ở phương
pháp này, hệ số cân bằng có giá trị là 1.04.
Biểu đồ 3 trình bày một vài kết quả thử nghiệm và dự đoán vài mẫu mô phỏng
toàn bộ phản ứng – CT (13) – với tham số được liệt kê ở bảng 3. Theo hình minh
hoạ, cả hai mẫu sản phẩm fructose và glucose được chỉ ra cho phản ứng đồng phân
học, sử dụng dung dịch thuốc thử ban đầu có nồng độ 0.5 và 1.0 mol/ L.

Biểu đồ tính toán trình bày sự cân bằng trong thử nghiệm, và xác định toàn bộ giá
trị của phản ứng, có lợi cho việc dự đoán phản ứng đồng phân học của glucose.
Sự tác động từ ngoài vào trong khiến đường được chuyển hoá. Tất cả các thử
nghiệm đều được kiểm tra dưới điều kiện tiến hành áp dụng cho thử nghiệm này,
sự khuếch tán vào bên trong màng film và khuếch tán vào trong các lỗ xốp thì
không có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình phản ứng.
1.2.3. Động học phản ứng đồng phân hóa glucose thành fructose
Enzyme cố định Sweetzyme IT, glucose isomerase thương mại có sẵn thu được từ
Công ty Novozyme, Đan Mạch được sử dụng trong nghiên cứu này. Ba mẫu glucose 10g,
15g và 20g được cân cẩn thận, sau do them 100 ml nước khử ion vào ba mẫu trong ba
bình tam giác 250ml để làm cho dung dịch đường glucose nồng độ ban đầu của 10, 15 và
20% tương ứng. Tất cả các bình được đậy lại bằng lá nhôm trong suốt thí nghiệm để ngăn
chặn sự bay hơi nước. Ba khối lượng enzyme khác nhau 0,5, 1,0 và 1,5 g được thêm vào
3 bình chứa 3dung dịch đường khác nhau. Mẫu được đặt riêng biêt trong một chậu nước
rung (Julabo SW23) được trang bị kiểm soát nhiệt độ vôi đo chính xác (+ 0,1°C). Các
đồng phân hóa nhiệt độ bao phủ khoảng 40-70°C. Tốc độ lắc đã được cố định tại 125 rpm
trong tất cả các thí nghiệm đồng phân hóa.
Các mẫu được phân tích đường sau mỗi hai giờ bằng cách sử dụng HPLC (Agilent
1100 series, mô hình G1362A) được trang bị một máy dò RI. Zorbax cột phân tích
carbohydrate, 4,6 mm x 150 mm, được duy trì ở 35ºC, được sử dụng để phân tích đường.
Giai đoạn di động (acetonitril trong nước khử ion; 70:30%) tốc độ dòng chảy là 1,5 ml /
phút.
Ban đầu, các thí nghiệm đồng phân hóa được thực hiện để tối ưu hóa việc nạp enzyme
và nhiệt độ phản ứng. Kết quả của việc tối ưu hóa và các mô hình động đề xuất được
trình bày trong các phần phụ sau.
Trong các thí nghiệm tối ưu hóa sơ bộ, phản ứng nhiệt độ đã được thay đổi từ 40 đến
70°C glucose ban đầu nồng độ 10%, 15% và 20% và khối lượng enzyme 0,5 g. Kết quả
cho thấy: ở 40°C, thời gian phản ứng hơn 60h không có sự khác biệt đồng phân hóa

glucose đạt được (8,3%, 8,1% và 7%) tương ứng với các nồng độ ban đầu 10%, 15% và
20%. Như vậy, để có được đồng phân hóa glucose cao hơn, thời gian phản ứng được tăng
lên đến mức cao nhất có thể. Kết quả của việc tăng nhiệt độ đồng phân hóa đến 60°C cho
thấy có sự chuyển đổi dạng kế của glucose. Glucose chuyển đổi ở 60°C đạt 40%, 29,8%
và 27,8% tương ứng với glucose ban đầu nồng độ 10%, 15% và 20%. Sau khi tăng thêm
nhiệt độ đồng phân hóa đến 70°C, glucose chuyển đổi đạt 40,9%, 35,8% và 33,6%. Nhiệt
độ phản ứng thí nghiệm tối ưu hóa cho thay giá trị chuyển đổi glucose ở 70°C là gần với
những kết quả thu được ở 60°C và cao hơn đáng kể so với những kết quả thu được ở
40°C. Tuy nhiên, tăng thêm nhiệt độ phản ứng vượt quá 70°C là điều không nên làm, vì
nó sẽ dẫn đến hiện tượng caramen hóa của đường, do đó mang lai màu sắc không mong
muốn đến kết quả cuối cùng của dung dich đường. Để tối ưu hóa tải enzyme, đồng phân
hóa 10% dung dịch glucose đã được tiến hành ở 60°C cho khối lượng ban đầu của
enzyme 0,5, 1,0 và 1,5 g. Kết quả thí nghiệm như vậy cho thấy, tại khoảng thời gian phản
ứng 40h khối lượng enzyme ban đầu 1.0 va 1.5 có sự khác biệt đáng kể về sự chuyển hoá
thành fructose (51,9% và 58,9%), trong khi đó với khối lượng enzyme ban đầu là 0,5 g
chỉ là 40% sau 60 giờ thời gian phản ứng đã được thể hiện trong hình 1.
Hai mô hình đã được nghĩ ra để mô tả các động học của phản ứng đồng phân hóa
glucose bằng cách sử dụng các dữ liệu thử nghiệm cho các nạp enzyme 1g ở nhiệt độ
phản ứng của 50ºC, 60ºC và 70ºC và nồng độ glucose ban đầu 10%, 15% và 20%. Mô
hình đầu tiên là một mô hình đơn giản không có hình phức tạp (gọi là Model 1) và thứ
hai là một mô hình phức tạp với một hình thành một bước phức tạp (gọi là Mô hình 2).
Cả hai mô hình giả định động học thứ tự đầu tiên cho các bước khác nhau. Việc kích hoạt
nguồn năng lượng tương ứng và các yếu tố theo hàm số mũ trước được đánh giá bằng
cách sử dụng phần mềm Excel và Runge-Kutta thuật toán lệnh tự thứ tư và phương pháp
bình phương it nhất cho giảm thiểu sai sót. Hằng số tốc độ được giả định theo
Arrehenius.
1.3. Streptomyces flavogrieus
1.3.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc Streptomyces spp.

Streptomyces là lớn nhất chi của Actinobacteria và chi nhập của gia đình
streptomycetaceae. Hơn 500 loài vi khuẩn Streptomyces đã được mô tả. Cũng như với các
Actinobacteria khác, Streptomyces là vi khuẩn gram dương, được tìm thấy chủ yếu trong
đất và thảm thực vật mục nát. Streptomyces có khả năng sản xuất bào tử. Streptomyces
được nghiên cứu rộng rãi nhất và được biết đến nhiều nhất là chi của họ xạ
khuẩn (atinomyces). Streptomyces thường sống ở đất và có vai trò là vi sinh vật phân hủy
rất quan trọng. Chúng cũng sản xuất hơn một nửa số thuốc kháng sinh của thế giới và đó
là sản phẩm có giá trị lớn trong lĩnh vực y tế.
1.3.1.1. Cấu trúc tế bào và trao đổi chất
Streptomyces được tìm thấy trên toàn thế giới, nhất là trong đất. Chúng đóng một vai
trò quan trọng trong sự phân giải các chất hữu cơ, thường có nhiều trong các đống phân
ủ.
Streptomyces có cấu trúc giống nấm. Nhánh của chúng sự sắp xếp của các tế bào hình
sợi thành một mạng lưới gọi là sợi nấm. Chúng có thể chuyển hóa các hợp chất khác
nhau bao gồm: đường, rượu, acid amin, và các hợp chất thơm bằng cách sản xuất các
enzym thủy phân ngoại bào. Do gen của chúng lớn nên trao đổi chất của chúng cũng đa
dạng, trong đó có hàng trăm nhân tố phiên mã kiểm soát biểu hiện gene, cho phép chúng
đáp ứng nhu cầu cụ thể.
Trên môi trường agar, xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử. Trên
thành sợi khí sinh thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử. Cuống sinh bào tử có nhiều
dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng xoắn, có móc, vòng,…Bào tử được hình thành
trên cuống sinh bào tử bằng 2 phương pháp: phân đoạn và cắt khúc. Bào tử xạ khuẩn có
hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5 µm. Màng tế bào có thể
nhẵn, gai khối u, nếp nhăn…. tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy.
1.3.1.2. Đặc điểm của Steptomyces
Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn gram (+), hiếu
khí, dị dưỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu thường là 25 – 300C, pH tối ưu 6,5 – 8,0.
Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa
lạnh).

Streptomyces có chu kỳ sống phức tạp bao gồm: hình thành các bào tử và các loại tế
bào khác. Thông thường, một bào tử nảy mầm trong điều kiện phải có chất nền để tạo ra
thực vật hoặc các sợi nấm. Điều này bao gồm một mạng lưới các nhánh sợi nấm mọc lên
và cắm vào bề mặt để hấp thu được chất dinh dưỡng.
Streptomyces và họ hàng của nó đã trở nên phổ biến nhờ vào khả năng sản xuất ra các
chế phẩm như: thuốc kháng sinh, thuốc kháng nấm, thuốc chống ung thư, ức chế miễn
dịch, thuốc diệt cỏ… Quá trình sinh tổng hợp của các hợp chất này khá khó khăn. Quy
định một cách cẩn thận với các quá trình của sự phân lập tế bào, bắt đầu trong việc
chuyển đổi sang sợi nấm trên môi trường thạch hoặc trong giai đoạn cuối theo cấp số
nhân (trong các môi truờng nuôi cấy lỏng).
Vì có cấu trúc tế bào nấm trong tế bào của chúng, nên cũng giống như nấm,
streptomyces cũng có chu kì đời sống phức tạp.
1.3.2. Phân lập Streptomyces flavogrieus
Do nhu cầu ngày sử dụng đường ngày càng tăng và giá cao, nên trong thập kỷ qua đã
tìm ra chất làm ngọt thay thế. Sản xuất syrup từ tinh bột để tăng vị ngọt và sử dụng là một
chất như thay thế đường. Việc sử dụng glucose isomerase để chuyển đổi glucose trong
ngô fructose syrup được thực hiện trong thực tế một thời gian. Một số lượng lớn các vi
sinh vật có khả năng sản xuất isomerase glucose đã được tìm thấy. Loài Streptomyces đã
được nghiên cứu rộng rãi và đã được sử dụng như là một nguồn sản xuất enzyme. Bao
gồm Streptomycesphaeochromogenes, S. albus, S. Bikiniensis, S. cinnamonensis, S.
flavovirens, S. fradiae, Streptomyces sp.. Các sinh vật khác bao gồm Aerobacter cloacae,
A.

aerogenes,

Lactobacillus

brevis,

Escherichia

intermedia,

Paracolobactrum

aerogenoides, Bacillus megaterium, B. coagulans, và Actinoplanes missouriensis…
Rơm rạ có chứa hemicellulose khoảng 25%, khoảng 65% trong số đó là xylose. Như
vậy, rơm rạ có thể là một chất nền tốt cho việc sản xuất glucose isomerase nếu một sinh
vật có khả năng sản xuất các enzyme và phát triển trên rơm.
Phân lập Streptomyces flavogriseus:
Mẫu đất đã được hòa vào trong nước vô trùng và cấy trên một môi trường có chứa:
-

1% hemicellulose rơm

-

0,03% vitamin Casamino axit (Difco)
0,2% KNO3
0,2% K2HPO4
0,2% NaCl
0,05% MgSO4.7H20
0,02% CaCO3
0,001% FeSO4.7H20
1,8% agar.
pH của môi trường đã được điều chỉnh đến 7.0.
Các khuẩn lạc bị phân lập được chuyển sang thạch nghiêng. Chủng từ các thạch

nghiêng sau đó được phát triển trong bình 250ml duy trì ở 30°C trên một máy lắc và
trong môi trường có chứa 1% hemicellulose rơm, 1% peptone, 0.5% chiết nấm men
và 0,1% MgSO4.7H20.
1.3.3. Chiết xuất enzyme glucose isomerase
Để sản xuất glucose isomerase, các vi sinh vật sẽ được nuôi trên một môi trường có
chứa:
-

1% hemicellulose rơm
2,5% rượu ngô
0,1% MgSO4.7H2O.

pH của các Môi trường sản xuất nên được duy trì tối đa 7.0 ngay cả sau khi hấp khử
trùng.
Sau thời gian ủ qua đêm, môi trường được ly tâm, khối tế bào được rửa hai lần bằng
nước cất. Thêm đệm natri phosphate 0,05 M (pH 7,0) vào khối tế bào tạo dịch huyền phù.
Enzyme của vi sinh vật thường được tách ra bởi sự phá vỡ cơ học lên thành tế bào
như đồng hóa áp lực cao, nghiền ẩm; hoặc không phải bằng phương pháp cơ học như
dùng hóa học, sinh học, vật lý... Phương pháp phổ biến nhất được sử dụng trong phòng
thí nghiệm cho quá trình tách glucose isomerase là phá vỡ thành tế bào bằng siêu âm.
Glucose isomerase dễ dàng giải phóng bởi sự tự phân. Chất tẩy rửa cation như
cetylpyridinium

chloride,

chloride

octadecyltrimethylammonium,

hoặc

clorua

dimethylbenzylalkylammonium được sử dụng cho việc tự phân trong dung dịch huyền
phù tế bào có chứa glucose isomerase.

Ngoài các chất tẩy rửa, lysozyme, toluene, hoặc sự kết hợp của lysozyme và toluen
được sử dụng cho sự phá vỡ thành tế bào của sinh vật sản xuất enzyme nhưng lại có hiệu
suất kém.
- Dung dịch được xử lý bằng một máy siêu âm ở trong 10 phút.
- Sau đó đem dịch đi ly tâm 20000 vòng trong 20 phúc ở để loại bỏ tế bào chết,
thu lấy phần dịch nổi.
-

Phần dịch nổi được thêm vào 30% amoni sulfat, sau đó đem đi ly tâm 20000 vòng

trong 15 phút, loại bỏ phần tủa. Thu lấy phần dịch nổi và bão hòa với 70% amoni sulfat.
-

Các hạt nhỏ thu được sau khi đem dịch trên ly tâm 20000 vòng trong 30 phút, sau

đó hòa tan trong nước cất.
-

Tinh sạch enzyme bằng phương pháp ướp muối dựa trên nguyên tắc enzyme

không hòa tan ở nồng độ muối cao. Khi nồng độ muối tăng lên, một số phân tử nước sẽ bị
hút bởi các ion muối, làm giảm số lượng phân tử nước liên kết hidro xung quanh enzyme,
giữa các enzyme hình thành tương tác kỵ nước, làm kết tinh enzyme.
1.3.4. Xác định hoạt tính glucose isomerase
Hoạt tính của Glucose isomerase được xác định theo phương pháp Dische và
Borenfreund.
Hỗn hợp phản ứng xác định hoạt tính enzyme chứa:
-

0,5 ml đệm natri phosphate 0,2 M (pH 7,0)

-

0,2ml dung dịch D-glucose 1M

-

0,1ml MgSO4.7H2O 0,1M

-

0,1ml CoCl2.6H20 0,01M

-

0,2 ml dung dịch enzyme.

Dung dịch đem cho chạy qua với 1 thiết bị khuấy đều trong 1 phút, sau đó đem ly tâm
12000 vòng/10 phút.
Dịch nổi được thu lấy, thêm nước cất vào cho đến 2ml. Hỗn hợp này được ủ ở 70°C
trong 1h, và phản ứng được dừng lại bằng cách thêm 2 ml acid percloric 0,5M.
Một trong những đơn vị hoạt tính của GI được định nghĩa là lượng enzyme sản xuất ra
1µmol D-fructose trên mỗi phút theo điều kiện đã có sẵn.

II. CỐ ĐỊNH ENZYME GLUCOSE ISOMERASE
Enzyme cố định thường là những enzyme hòa tan được gắn vào một chất mang.
2.1. Đặc điểm của enzyme cố định
Tại cuộc hội thảo về công nghệ enzyme vào năm 1971 ở New Hampshire (Mỹ), lần
đầu tiên công nghệ cố định enzyme được đưa ra thảo luận và thống nhất sử dụng bốn
nhóm công nghệ cố định enzyme.
Vật liệu cố định enzyme thường có kích thước hạt khoảng 0,5 – 1mm, tương ứng với
diện tích bề mặt hạt >50m2/g, với đường kính lỗ trung bình khoảng 10 – 15nm.
- Mục đích
Hạn chế sự di chuyển tự do của enzyme nhờ phương pháp vật lý hay hóa học.
Tiên tiến hơn enzyme tự do (enzyme tự do không thu hồi được sau phản ứng và dễ bị
mất độ bền hơn).
- Ưu điểm
Có thể tái sử dụng một lượng enzyme xác định trong một thời gian, do đó tiết kiệm
được enzyme và làm tăng hiệu quả kinh tế.
Dể dàng thu hồi sản phẩm.
Dể dàng kiểm soát quá trình.
Thời gian lưu ngắn.
Tối ưu hóa được hiệu suất.
Hoạt tính ổn định hơn so với enzyme thự do khi có sự thay đổi của môi trường.
Enzym cố định có tính bền nhiệt hơn enzyme hòa tan cùng loại
Enzym cố định có khả năng bảo quản tốt hơn.
Có thể tái sử dụng enzym cố định nhiều lần.
- Hạn chế
Hoạt tính của enzym cố định thường nhỏ hơn hoạt tính riêng của enzym hòa tan
cùng loại.
Enzym cố định có xu hướng chuyển dịch pH tối ưu sang kiềm hoặc acid so với pH
tối của enzym hòa tan.
Enzym cố định có khả năng bảo quản tốt hơn

- Enzym cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis – Menten. Tuy nhiên:
+ Có thể sẽ xảy ra hiện tượng cạnh tranh cơ chất với enzym và chất mang.
+ Hiện tượng cản trở sự khuếch tán cơ chất và các sản phẩm của phản ứng làm
giảm tốc độ phản ứng
- Enzyme cố định hoàn toàn tuân theo định luật michaelis-Menten. Tuy nhiên:
+ Có thể sẽ xảy ra hiện tượng cạnh tranh cơ chất với enzyme và chất mang.
+ Hiện tượng cản trở sự khuếch tán cơ chất và các sản phẩm của phản ứng làm
giảm tốc độ phản ứng.
2.2. Các phương pháp cố định enzyme

Hấếp phụ (Adsorpton)

Nhốết
(Entrapmen
t)

Phương pháp cốế
định enzyme

Cross
linking

Liên kêết cộng hóa trị (Covalent)

Hình. Các phương pháp cố định enzyme
 Cố định enzyme thông qua tạo liên kết cộng hóa trị:
Tạo liên kết hóa trị với vật liệu mang được hoạt hóa thông qua các gốc tư do –NH2, –
OH, –SH ở mạch bên của các amino acid.

Hình. Họat hóa chất mang bằng CNBr (độc) dể tạo liên kết
cộng hóa trị với enzyme
 Cố định enzyme thông qua phương pháp nhốt:
Tiến hành nhốt enzyme vào chất nền tạo gel tự nhiên hay gel tổng hợp, có bản chất là
polyme là khá đơn giản.
Alginate và Caraghehan lấy từ rong biển thường có khả năng tạo gel tốt, thuâ ân lợi để
gói enzyme và tế bào. Canxialginate là mô ât trong những vâ ât liê uâ thích hợp cho phương
pháp nhốt enzyme. Hỗn hợp enzyme và alginate được nhỏ xuống dung dịch CaCl 2 để tạo
hạt.
Ưu điểm: khá phù hợp để sử dụng cho mục đích cố định tế bào.
Nhược điểm: Gel dạng hình cầu lại mềm và xốp, độ bền cơ học thấp, khó có thể nhồi
vào cột phản ứng nên ít được sử dụng. Ion Ca2+ đóng vai trò làm chất kết nối gel thường
dễ bị hòa tan khi bổ sung thêm muối.

Tạo gel alginate

Tạo gel
polyacryamide