Nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng rutin trong phát triển của hoa hòe và nụ hoa hòe chế biến theo y học cổ truyền bằng phương pháp HPTLC

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TỐNG XUÂN QUANG

NGHIÊN CỨU SỰ THAY ĐỔI
HÀM LƯỢNG RUTIN TRONG PHÁT
TRIỂN CỦA HOA HOÈ VÀ NỤ HOA
HOÈ CHẾ BIẾN THEO Y HỌC CỔ
TRUYỀN BẰNG PHƯƠNG PHÁP
HPTLC
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ KHOÁ 65

HÀ NỘI – 2015

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TỐNG XUÂN QUANG

NGHIÊN CỨU SỰ THAY ĐỔI
HÀM LƯỢNG RUTIN TRONG PHÁT
TRIỂN CỦA HOA HOÈ VÀ NỤ HOA
HOÈ CHẾ BIẾN THEO Y HỌC CỔ
TRUYỀN BẰNG PHƯƠNG PHÁP
HPTLC
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn
1. TS. Nguyễn Quốc Huy.
2. PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển
Nơi thực hiện
Bộ môn Thực Vật

HÀ NỘI - 2015

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới
TS. Nguyễn Quốc Huy và PGS.TS. Nguyễn Mạnh Tuyển, người thầy đã trực tiếp
hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình
thực hiện đề tài này.
Tôi xin bày tỏ lòng chân thành cảm ơn tới:
Khoa Kiểm nghiệm Đông dược của viện Kiểm nghiệm Trung ương đã hỗ trợ và
cung cấp nguyên liệu tôi trong quá trình làm.
DS Nguyễn Thị Thuỳ Linh đã hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi rất nhiều kinh nghiệm
trong quá trình nghiên cứu khoa học tại bộ môn.
Tập thể giảng viên, kỹ thuật viên bộ môn Thực vật và bộ môn Dược học cổ truyền
đã hết lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận.
Bạn Phạm Thị Việt Hồng – M2K65, bạn Lương Thị Lan – M1K65, Quách Thị
Thuý Nga – M2K65, đã luôn hỗ trợ, giúp đỡ, động viên tôi trong thời gian nghiên
cứu khoa học tại bộ môn.
Và tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban giám hiệu, các thầy cô
giáo trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dìu dắt tôi trong suốt 5 năm học
qua, cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên tôi.
Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2015
Sinh viên

Tống Xuân Quang

MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ…………….…………………………………………………..…..

1

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN….……………………………………………..…...

3

HOÈ……..…………..…………………………………………………….

3

1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố.……………………………………….……

3

1.1.2. Thành phần hoá học…….…………………………………………….…...

4

1.1.3. Tác dụng sinh học , chế biến và công dụng ……….……………….……..

5

1.1.3.1.

Tác dụng sinh học……………………………………………….…….

5

1.1.3.2.

Chế biến theo YHCT và công dụng ………………………………….

6

TỔNG QUAN VỀ RUTIN……………………………………….……….

7

1.2.1. Tính chất vật lý rutin ……………………………………………….…….

7

1.2.2. Định tính rutin …………………………………………………….……...

8

1.2.3. Định lượng rutin………………………………………………….……….

9

1.2.4. Một số nghiên cứu về rutin ….……………………………………………

11

SẮC KÝ LƠP MỎNG HIỆU NĂNG CAO ….…………………………..

11

1.3.1. Sắc ký lớp mỏng ..…………………………………………..……..………

11

1.3.1.1. Nguyên tắc…………………………………………………………..…..

11

1.3.1.2. Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng…………………………………….…………

13

1.3.2. Đặc điểm chung của sắc ký lớp mỏng hiệu năng hiệu năng cao-HPTLC…

15

1.3.3. Ứng dụng của HPTLC trong nghiên cứu dược liệu………………………..

16

1.3.2.1. Định tính …………………………………………………………………

16

1.3.2.2. Bán định lượng ………………………………………………………..…

17

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …….............

20

2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU …………………….….…..

20

2.1.1. Nguyên liệu ………………………...………………………………...……

20

1.1.

1.2.

1.3.

2.1.2. Hóa chất và dụng cụ………………………………………………………..

23

2.1.2.1. Máy móc và dụng cụ thí nghiệm……………………………………...….

23

2.1.2.2. Hóa chất………………………………………………………….……….

23

2.2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………….

24

2.2.1. Nội dung nghiên cứu ……………………………………………….………

24

2.2.2. Phương pháp nghiên cứu……………………………………………..…….

24

2.2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng………………………………………

24

2.2.2.2. Định lượng hàm lượng Rutin trong quá trình phát triển hoa và trong các

29

mẫu chế biến theo YHCT…………………………………......................
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……………………………………….

30

3.1. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM……………………………….………………..

30

3.1.1. Xây dựng phương pháp định lượng bằng HPTLC ………………………...

30

3.1.1.1. Xử lý mẫu thử …………………………………………………….……..

30

3.1.1.2. Lựa chọn dãy nồng độ chuẩn …………………………………………….

32

3.1.1.2. Lựa chọn độ pha loãng thích hợp ………………………………………..

34

3.1.1.3. Thẩm định phương pháp …………………………………………………

35

3.1.2. Định lượng hàm lượng hoạt chất rutin trong phát triên hoa hoè và sau khi

39

chế biến theo YHCT ……………………………………………………………………
3.1.3. Đánh giá hàm lượng rutin trong chế biến nụ hoa hoè theo YHCT…………

40

3.1.3.1. Kết quả so sánh hàm lượng rutin trong phát triển của hoa hoa hoè …….

41

3.1.3.2. Kết quả so sánh hàm lượng rutin trước và sau khi chế biến theo YHCT ..

41

3.2. BÀN LUẬN ………………………………………………………………………...

42

3.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng ….……………………………………………

42

3.2.2. Sự thay đổi hàm lượng rutin của hoa hoè trong phát triển hoa hoè và trong chế

43

biến theo YHCT ………………………….……………………………………………...
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ …………………………………………………………..

46

KẾT LUẬN ……………...………………………………………………………………

46

KIẾN NGHỊ ..……………………………………………………………………………

47

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ĐC

Đối chiếu

IR

Infrared Radiation

HPTLC

High Performance Thin Layer Chromatigraphy

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

MS

Mass spectrometry

NMR

Nuclear magnetic resonance

Rf

Retention factor (Hệ số lưu)

RSD

Độ lệch chuẩn

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

STT

Số thứ tự

S.

Stypholobium

TB

Trung bình

TT

Thuốc thử

TLC

Thin Layer Chromatography

YHCT

Y học cổ truyền

UV

Ultraviolet

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1 Các nguồn có chứa rutin khác .………………………………………

12

Bảng 1.2 Một số chất làm pha tĩnh cho TLC …………………………………..

13

Bảng 1.3 Một số thuốc thử tạo màu trong nghiên cứu dược liệu ………………

15

Các mẫu nghiên cứu …………………………………………………

21

Bảng 2.2 Các dãy nồng độ của dung dịch mẫu chuẩn (mg/ml) ………………..

25

Bảng 3.1 Độ pha loãng của các mẫu …………………………………………...

35

Bảng 3.2 Nồng độ rutin chuẩn và diện tích pic đáp ứng ……………………….

36

Bảng 3.3

Giá trị Rf và diện tích pic của các vết ……………………………….

37

Bảng 3.4

Kết quả khảo sát độ đúng ……………………………………………

38

Bảng 2.1

Bảng 3.5 Hàm lượng rutin tích luỹ trong quá trình phát triển hoa và sau khi
chế biến theo YHCT …………………………………………………

39

Bảng 3.6

So sánh hàm lượng rutin giữa các mẫu với nụ non ………………….

41

Bảng 3.7

So sánh hàm lượng rutin trước và sau khi chế biến theo YHCT ……

42

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Trang
Hình 1.1

Cây hoè và hoa hoè .………………………………………………

3

Hình 1.2

Các thành phần hoá học có trong nụ hoa …………………………

4

Hình 1.3

Cấu trúc hoá học của Rutin và Quercetin ……………………..…..

7

Hình 2.1

Cây hoè tại vườn ………………………………………………….

20

Hình 2.2

Hình ảnh hệ thống máy sắc ký HPTLC ……………………………

23

Hình 3.1

Sắc ký đồ mẫu chuẩn và thử tại 3 hệ dung môi soi tại ánh sáng
trắng và bước sóng 254nm …………………………………………

30

Hình 3.2

Pic sắc ký chuẩn rutin tại hệ dung môi 3 …………………….….....

31

Hình 3.3

Pic sắc ký chuẩn rutin tại hệ dung môi 2 …………………………..

31

Hình 3.4

Đường chuẩn của dãy chuẩn 1 …………………….………………

32

Hình 3.5

Đường chuẩn của dãy chuẩn 2 …………………….………………

32

Hình 3.6

Đường chuẩn của dãy chuẩn 3 ………………………...…………..

32

Hình 3.7

Đồ thị đường chuẩn rutin theo chiều cao pic ………………..……..

33

Hình 3.8

Đồ thị đường chuẩn rutin theo diện tích pic …………………….…

34

Hình 3.9

Sắc ký đồ tại bước sóng 254nm …………………………………....

35

Hình 3.10

Kết quả chồng pic của mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu trắng ………...

36

Hình 3.11

Mối liên hệ giữa nồng độ và diện tích pic …………………………

37

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là nước có hệ thực vật phong phú, trong đó có khoảng 4000 loài
thực vật có thể làm thuốc trong các nền y học dân gian, 800 loài thường được dùng
trong y học cổ truyền (YHCT) chính thống và 300 loài dùng trong công nghiệp
dược [38]. Như vậy có thể thấy tiềm năng về cây thuốc ở Việt Nam còn rất lớn. Tìm
chất mới cũng như nâng cao giá trị các dược liệu đã có là việc làm cần thiết phát
triển nền YHCT Việt Nam.
Hoè (Styphnolobium japonicum (L.) Schott.) là vị thuốc YHCT rất phổ biến
tại Việt Nam nhất là một số tỉnh duyên hải Bắc bộ như Thái Bình, Nam Định, hoè
được trồng làm cảnh, làm thuốc chữa bệnh… Từ xa xưa nụ hoa hoè đã được sử
dụng làm thuốc và chế biến nhiều cách như sao vàng, sao cháy hay thán sao để sử
dụng trong các bài thuốc. Rutin là một flavonoid có nhiều trong các loài thực vật.
Trong Công nghiệp Dược, rutin được chiết xuất từ các phần của cụm bông hoa hoè
cho hiệu suất cao, là nguồn nguyên liệu, vị thuốc được sử dụng nhiều trong đời
sống và y học do đó hoa hoè được chuẩn hoá về dược liệu và hàm lượng rutin trong
dược liệu trong Dược Điển Việt Nam và trong 1 số dược điển nước khác như Trung
Quốc, Nhật Bản [3].
Hoa hòe được sử dụng trong YHCT và chiết rutin cho công nghiệp dược.
Thực tế hiện nay, người dân thu hái tự phát chưa theo quy trình chuẩn về thời điểm
thu hái và tiêu chuẩn của nụ hòe để có nguồn nguyên liệu chất lượng. trong YHCT
thì nụ hoè có thể vi sao, sao vàng hay là thán sao (sao đen) [5], [7.] Với mỗi dạng
chế biến có nhưng công dụng chỉ định, cách dùng trong các bài thuốc trong YHCT
khác nhau như hạ huyết áp cho người cao huyết áp, thanh nhiệt, cầm máu, chỉ
huyết. Toàn bộ quá trình này chưa có những đánh giá chuẩn hóa từ thu hái đến chế
biến cũng như đánh giá hàm lượng rutin trong nụ hòe. DĐVN [3] đã hướng dẫn sử
dụng phương pháp đo quang để định lượng rutin [3]. Nhưng đo quang thì có nhiều
bất lợi với phân tích dược liệu do dịch chiết tổng chứa nhiều chất gây tạp. Nếu sử
dụng phương pháp HPLC cho đánh giá thì chi phí cao hơn nhiều. Hiện nay HPTLC
là phương pháp, đã và đang được sử dụng trong phân tích dược liệu và đánh giá

2

nhanh hàm lượng các chất hiện. Do đó, đề tài “Nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng
Rutin trong sự phát triển của hoa hòe và nụ hoa hòe chế biến theo YHCT bằng
phương pháp HPTLC” với mục tiêu sau :
1. Xây dựng phương pháp bán định lượng hoạt chất rutin trong hoa hoè bằng
phương pháp HPTLC.
2. Đánh giá sự tích luỹ hàm lượng hoạt chất rutin trong một số mẫu hoa hoè
trong quá trình phát triển và nụ sau khi chế biến theo YHCT

3

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN
1.1. HOÈ
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố [5], [8], [10], [19].
- Hoè - Styphnolobium japonicum (L.) Schott. hay có tên khoa học khác là
Sophora japonica L. Schott. , chi Styphnolobium, tông Sophoreae, họ Đậu
(Fabaceae), phân bộ Đậu (Fabales), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan
(Magnoliophyta) [16].
- Hoè hay còn được gọi là hoè hoa, Lài Luồng (Tày). Tại một số quốc gia khác có
tên là Hòe Thực (Bản Kinh), Hòe Nhụy (Bản Thảo Đồ Kinh), Hòe nhụy (Bản Thảo
Chính), Thái dụng (Nhật Hoa Tử Bản Thảo), Hòe mễ, Hòe hoa mễ, Hoà trần mễ
(Hòa Hán Dược Khảo), Hòe hoa thán, Hòe mễ thán, Hòe nga, Hòe giao, Hòe nhĩ,
Hòe giáp (Trung Quốc Dược Học Đại Từ Điển) [2], [16],[29].
- Hoè là một cây gỗ, to, cao 5-15m, thân thẳng, có chỏm lá tròn lá kép lông chim
lẻ, mọc so le, mỗi lá có từ 9-13 lá chét, lá chét hình trứng, đỉnh nhọn, nguyên dài 34 cm, rộng 1.5 -2.5 cm [19]. Hoa mọc thành cụm, hình chuỳ ở đầu cành; tràng hoa
hình bướm màu trắng ngà. Nụ hoa hình trứng có cuống nhỏ, ngắn, một đầu hơi
nhọn, dài 3 - 6 mm, rộng 1 - 2 mm, màu vàng xám. Đài hoa hình chuông, màu vàng
xám, dài bằng 1/2 đến 2/3 chiều dài của nụ hoa, phía trên xẻ thành 5 răng nông. Hoa
chưa nở dài từ 4 - 10 mm, đường kính 2 - 4 mm. Cánh hoa chưa nở màu vàng.

Hình 1.1. Cây hoè và hoa hoè
- Quả loại đậu, không mở, vỏ dày, có thắt nhỏ lại ở giữa các hạt. Quả dài 5-8cm,
khi khô có màu nâu đen, chứa 4-6 hạt hình bầu dục, hơi dẹp, đen bóng [16].

4

- Mùa ra hoa khoảng từ tháng 6-11 hàng năm, Hoè được nhân giống bằng cách
giâm cành, thường sau khi trồng từ 3-4 năm mới ra hoa và cây từ 6-7 tuổi trở đi cho
hoa nhiều và sản lượng cao [5].
- Loài S. japonicum (L.) Schott. phân bố nhiều ở Việt Nam, Trung Quốc, Nhật
Bản, Triều Tiên [27] được trồng dùng làm thuốc hay làm cảnh, lấy bóng râm. Tại
Việt Nam, Hoè được trồng nhiều tại các tỉnh như Thái Bình, Hải Dương, Hưng
Yên, Nam Định, Nghệ An. Những năm gần đây còn được trồng ở các tỉnh khác như
Tây Nguyên, một số tỉnh miền Trung [2], [29].
1.1.2. Thành phần hoá học
Flavonoid là nhóm hoạt chất chính chiếm số lượng nhiều trong thành phần
hoá học của cây, rutin chiếm tỉ lệ lớn nhất (6-38% rutin trong nụ) [8].
1.1.2.1. Nụ hoa [5], [8], [16], [19].
- Nụ hoa hoè chứa nhiều và chủ yếu là rutin, Hoè Việt Nam có hàm lượng rutin
cao, có tỉ lệ từ 6-30% có thể lên tới 38% trong nụ. Phần aglycon của rutin là
quercetin (= Quercetol) thuộc nhóm flavonol, phần đường là Rutinose [5].

Rutin

Betuin

Sophoradiol

Hình 1.2. Một số hợp chất hoá học có trong nụ hoa hòe

5

- Ngoài ra trong Hoa hoè còn có các hoạt chất khác như Bentulin, Lupan,
Sophoradiol, Sophorin A, Sophorin B và Sophorin C. Và một số alcaloid như
Oxymatrine , cytisin, N-methyl cytisin, sophocarmin, matrin [19]. Trong đó, Betulin
là một dẫn chất triterpenoid thuộc nhóm Lupan, Sophoradiol là dẫn chất thuộc
nhóm olean [8], [5], [19].
1.1.2.2. Quả
Trong hạt hoè có chưa các alcaloid như cytisin, N-methyl cytisin,
sophocarmin, matrin... các flavonoid như rutin, sophorine.... Ngoài ra còn chứa các
Polysaccharides như galactomannans, các dầu béo, protein và khoáng chất. Trong
vỏ quả hoè có nhóm flavonoid chiếm 10.5%, chủ yếu là các chất chuyển hoá như
genistein, sophoricoside (hay genistein-4'-glucoside), sophorabioside (phần biose
gồm glucose và rhamnose), Kaempferol, Rutin..; Sophorose [5], [19].
1.1.2.3. Lá
Lá chứa 6.6% flavonoid toàn phần trong đó có 4.7 % rutin [5], [19].
1.1.2.4. Các bộ phận khác
Trong cành có chứa khoảng 0.1-2% rutin, trong vỏ cây cũng có chứa rutin
nhưng tỉ lệ thấp. Trong rễ có chứa (D,L)-Maackian, Amhydropisatin, Pterocarpane,
Sophojaponicin, Flavonoids..[5], [16], [19].
1.1.3. Tác dụng sinh học, chế biến và công dụng
1.1.3.1. Tác dụng sinh học [16],[19].
Rutin là 1 loại vitamin P, có tác dụng tăng cường sức chịu đựng của mao mạch.
Chữa P là chữ đầu của chữ peméabilité có nghĩa là thấm. một số chất khác cũng có
tính chất vitamin P như esculozit, hesperidin (trong vỏ cam), v..v…[9].
 Rutin có tác dụng chủ yếu là bảo vệ sức chịu đựng bình thường của mao mạch.
Thiếu vitamin này tính chất chịu đựng của mao mạch có thể bị giảm, mao mạch dễ
đứt vỡ, hiện tượng này trước đây người ta chỉ cho rằng cơ thể thiếu Vitamin C mà
có , gần đây mới phát hiện sự liên quan đến Vitamin P [19].
 Rutin thường dùng cho bệnh nhân cao huyết áp mà mao mạch dễ vỡ đứt, để đề
phòng đứt mạch máu ở não, xuất huyết cấp tính di viêm thận, xuất huyết cấp tính do

6

viêm thận, xuất huyết ở phổi mà không rõ nguyên nhân, còn có tác dụng đối với
bệnh cao huyết áp.
- Theo Parrot thì cơ chế, tác dụng của vitamin P như sau : vitamin P làm giảm sự
phân huỷ adrenalin trong cơ thể, gần đây có nghiên cứu chỉ ra rằng adrenalin có tác
dụng tăng sức chịu đựng của mao mạch vì thế mà vitamin P có tác dụng tăng sức
chịu đựng của mao mạch và tăng cường [19].
- Theo Hoàng Chiêu Đức (Trung nam y học tạp chí, 1952) [19] :
 Nước sắc hoa hoè loại bỏ rutin đi rồi vẫn có thể làm giảm huyết áp của chó gây
mê.
 Có tác dụng hưng phấn nhẹ đối với tim cô lập của ếch.
 Có tác dụng kích thích sự bài tiết của niêm mạc ruột.
- Có nghiên cứu khác trên tử cung có thai và không có thai đều thấy có tác dụng
kích thích và đối với chó gây mê có tác dụng lợi tiểu tạm thời [19].
1.1.3.2. Chế biến theo YHCT và công dụng [5], [10], [16], [19].
- Chế biến theo YHCT [23] :
 Khi trời khô ráo (thường vào buổi sáng), ngắt các chùm hoa chưa nở, tuốt lấy nụ,
loại bỏ các bộ phận khác của cây, phơi nắng hoặc sấy nhẹ cho đến khô.
 Hoa hoè chủ yếu sử dụng nụ hoa để chế biến, ngoài ra quả được sử dụng.
 Các dạng chế biến của nụ hoa hoè gồm sao vàng, sao đen.
-

Công dụng [7], [19] :

 Tính chất hoa hoè theo tài liệu cổ : Hoa có vị đắng tính bình, quả vị đắng tính hàn
[7]. Quả quy vào kinh can. Có tác dụng lương huyết, thanh nhiệt, chỉ huyết ( hoa).
 Hoa hoè vi sao, sao vàng, sao đen đều có tác dụng hạ áp nhưng sao đen tác dụng
hạ áp mạnh hơn[19].
 Quả có tính chất gần như hoa nhưng có thể gây xảy thai, dùng để chữa xích bạch
lỵ, trĩ ra máu, thổ huyết máu cam, phụ nữ băng huyết.
 Hiện nay, nhân dân dùng hoa hoè làm thuốc cầm máu, dùng trong cách bệnh ho ra
máu, đổ máu cam, tiểu tiện ra huyết ruột chảy máu.

7

1.2. TỔNG QUAN VỀ RUTIN
Flavonoid là một nhóm chất lớn có mặt ở trong hầu hết các loài thực vật hiện
nay. Theo các nghiên cứu hiện nay, các Flavonoid có rất nhiều tác dụng và có nhiều
hoạt chất có cấu trúc tính chất gần giống với các vitamin cần thiết cho cơ thể.
Flavonoid chia làm 4 nhóm là Eucoflavonoid, Isoflavonoid, Neoflavonoid,
Triflavonoid . Trong đó nhóm Eucoflavonoid có các nhóm như flavon, flavonol,
flavanol, chalon...[5]. Rutin là một chất thuộc nhóm Eucoflavonoid trong nhóm
flavon và flavonol.
1.2.1. Tính chất vật lý của rutin
 Rutin có tên IUPAC : 2 - ( 3,4-dihydroxyphenyl ) - 5,7 – dihydroxy – 3 - {[(
2S,3R,4S,5S,6R ) - 3,4,5 – trihydroxy – 6 - ({[( 2R,3R,4R,5R,6S ) - 3,4,5 –
trihydroxy – 6 – methyloxan – 2-yl] oxy} methyl) oxan - 2-yl] oxy} - 4H- chromen
– 4 – one hay có tên khác là : 3.3’,4’,5,7-pentahydroxyflavon 3-Rutinosid.
 Rutin là một glucosid chiết được từ nụ hoa cây Hòe (S. japonicum L), họ Đậu
(Fabaceae), hoặc từ nhiều cây khác thuộc các họ thực vật khác nhau. Rutin là một
chất thuộc nhóm Flavon, có phần aglyol là Quercetin thuộc nhóm Flavonol [3],[5],
[35].

Quercetin
Rutin

Rhamnose

Glucose

Hình 1.3. Cấu trúc hoá học của Rutin và Quercetin
-

Tính chất vật lý [3] :

 Bột kết tinh màu vàng hay vàng lục.

8

 Tan trong methanol và trong các dung dịch hydroxyd kiềm, hơi tan trong ethanol,
thực tế không tan trong nước và dichloromethan.
 Phổ của rutin có λmax ở 362,5 và 258 nm, ở λ = 362.5 thì có E(1%, 1cm) = 325
(ethanol) [5].
1.2.2. Định tính rutin
Theo dược điển Việt Nam IV, các phương pháp dùng để định tính rutin :
- Phương pháp A: So sánh phổ hồng ngoại với phổ chuẩn [3].
Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của rutin chuẩn
(Đối chiếu).
- Phương pháp B : Đo quang [3] .
Hòa tan 50.0 mg chế phẩm trong methanol và pha loãng thành 250.0 ml với
cùng dung môi, lọc nếu cần. Pha loãng 5,0 ml dung dịch này thành 50.0 ml bằng
methanol. Đo phổ hấp thụ tử ngoại trong khoảng từ 210 nm đến 450 nm, dung dịch
phải cho hai cực đại hấp thụ ở 257 nm và 358 nm. Độ hấp thụ riêng ở bước sóng
cực đại 358 nm phải từ 305 đến 330. tính theo chế phẩm khan.
- Phương pháp C: Phương pháp sắc ký lớp mỏng [3].
 Bản mỏng: Silica gel GF254.
 Dung môi khai triển: N-butanol - acid acetic khan - nước - methyl ethyl ceton ethyl acetat (5 : 10 : 10 : 30 : 50).
 Dung dịch thử: Hòa tan 25 mg chế phẩm trong methanol và pha loãng thành 10.0
ml với cùng dung môi .
 Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 25 mg Rutin chuẩn (Đối chiếu) trong methanol và
pha loãng thành 10.0 ml với cùng dung môi.
 Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl mỗi dung dịch trên. Triển
khai sắc ký đến khi dung môi đi được 10 cm. Để khô bản mỏng ngoài không khí.
Phun lên bản mỏng hỗn hợp gồm 7.5 ml dung dịch kali fericyanid 1% (Thuốc thử)
và 2.5 ml dung dịch sắt (III) clorid 10.5% (Thuốc thử). Quan sát bản mỏng trong
vòng 10 phút. Vết chính trên sắc ký đồ thu được của dung dịch thử tương ứng về vị

9

trí, màu sắc và kích thước với vết chính trên sắc ký đồ thu được của dung dịch đối
chiếu.
- Phương pháp D: [3]
Hòa tan 10 mg chế phẩm trong 5 ml ethanol 96% (Thuốc thử). Thêm 1 g kẽm
(Thuốc thử) và 2 ml dung dịch acid hydrocloric 25% (Thuốc thử), sẽ xuất hiện màu
đỏ.
- Phương pháp E : Phản ứng với hơi amoniac [3].
Nhiều flavonoid thay đổi màu khi gặp hơi NH3. Có thể quan sát sự biến đổi màu
này bằng mắt thường hoặc dưới ánh sáng tử ngoại.
- Phương pháp F : Phản ứng cyanidin [3].


Phản ứng do sự có mặt nhân γ-penzopyron trong đa số flavonoid. Thuốc thử là

HCl đặc và bột Magie kim loại.
 Phản ứng bằng thuốc thử Sibata và dung dịch H2SO4 đậm đặc.
 Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài mililit H2SO4 đậm đặc, sau đó cho
thêm 0.1 gam Magie, tiếp theo thêm từ từ rượu isoamylic theo thành ống nghiệm.
Đun nóng, có màu hồng từ từ xuất hiện rồi chuyển sang đỏ cam hoặc đỏ tím.
- Phương pháp G : Phản ứng với dung dịch sắt (III) clorid 5% [3].
Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5%, lắc
sẽ xuất hiện màu xanh đen.
1.2.3. Định lượng rutin
Có nhiều phương pháp để định lượng:
- Đo bằng quang phổ kế : Nguyên tắc dựa vào phổ của rutin có λmax ở 362.5 và
258 nm, ở λ = 362.5 thì có E(1%, 1cm) = 325 (ethanol), Đo quang phổ kế để tính
nồng độ dựa trên E (1%, 1cm) [5].
- Đo màu : Nguyên tắc dựa vào màu của rutin khi tác dụng với AlCl3 hoặc tiến
hành phản ứng Cyanidin rồi đo màu [5].
- Phương pháp cân : nguyên tắc của phương pháp là chiết xuất rutin bằng cồn
nóng, sau đó thuỷ phân bằng dung dịch acid sufuric, quercetin ít tan được lọc và cân
rồi tính ra rutin.

10

- Theo Dược điển Việt Nam IV quy định [3] :
 Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0.2 g rutin chuẩn đã sấy khô (trong chân
không) tới khối lượng không đổi, cho vào một bình định mức 100 ml. Hoà tan trong
70 ml methanol (Thuốc thử) bằng cách làm ấm trên cách thuỷ. Để nguội, thêm
methanol (Thuốc thử) đủ 100 ml, lắc kỹ. Lấy chính xác 10 ml dung dịch này cho
vào một bình định mức 100 ml khác. Thêm nước tới vạch, lắc kỹ (mỗi ml chứa 0.2
mg Rutin khan).
 Xây dựng đường cong chuẩn: Lấy chính xác 1.0 – 2.0 - 3.0 – 4.0 – 5.0 và 6,0 ml
dung dịch chuẩn cho vào bình định mức 25 ml riêng biệt, thêm nước cho tới 6 ml ở
mỗi bình rồi thêm 1 ml dung dịch natri nitrit 5% (Thuốc thử), trộn kỹ. Để yên 6
phút, thêm 1 ml dung dịch nhôm nitrat 10% (Thuốc thử), trộn kỹ, lại để yên 6 phút.
Thêm 10 ml dung dịch natri hydroxyd 10% (Thuốc thử), thêm nước tới vạch, trộn
kỹ và để yên trong 15 phút. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 500 nm. Vẽ đường cong
chuẩn, lấy độ hấp thụ là trục tung, nồng độ là trục hoành.
 Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 1 g bột dược liệu thô đã sấy khô ở 60oC
trong 6 giờ cho vào bình Soxhlet. Thêm 120 ml ether (Thuốc thử), chiết tới khi dịch
chiết không màu. Để nguội và gạn bỏ ether. Thêm 90 ml methanol (Thuốc thử) và
chiết tới khi dịch chiết không còn màu. Chuyển dịch chiết vào một bình định mức
100 ml, rửa bình chiết bằng một lượng nhỏ methanol rồi cho tiếp vào bình định
mức. Thêm methanol cho tới vạch và lắc kỹ. Lấy chính xác 10 ml dung dịch trên
cho vào bình định mức 100 ml, thêm nước tới vạch và trộn kỹ. Lấy chính xác 3 ml
cho vào bình định mức 25 ml, thêm 3 ml nước rồi thêm 1 ml dung dịch natri nitrit
5% (Thuốc thử), trộn kỹ. Để yên 6 phút, thêm 1 ml dung dịch nhôm nitrat 10%
(Thuốc thử), trộn kỹ, để yên 6 phút. Thêm 10 ml dung dịch natri hydroxyd 10%
(Thuốc thử), thêm nước tới vạch, trộn kỹ và để yên trong 15 phút. Đo độ hấp thụ ở
bước sóng 500 nm. Tính khối lượng rutin (µg) của dung dịch thử từ nồng độ đọc
được trên đường cong chuẩn xây dựng trên độ hấp thụ và tính hàm lượng phần trăm
rutin trong dược liệu thông qua độ hấp thụ.
 Hàm lượng rutin trong nụ hoa hoè không ít hơn 20%.

11

1.2.4. Một số nghiên cứu về rutin.
-

Rutin là một chất được sử dụng rộng rãi trong thuốc và đang được tìm hiểu

rất nhiều về thành phần, cấu trúc và tác dụng sinh học. Ngoài ra còn có những
nghiên cứu các nguồn nguyên liệu chiết xuất rutin khác nhau trong cây cỏ và nghiên
cứu so sánh hàm lượng rutin tích luỹ giữa các vùng trồng với nhau.
-

Năm 1842, lần đầu tiên rutin được phân lập từ cây cửu lý hương – Ruta

graveolens L. bởi dược sĩ người Đức – Weyb. Nhưng 100 năm sau, rutin mới được
sử dụng nhiều trong Y học.
-

Hlasiwetz và nhiều người khác đã tiến hành nghiên cứu cấu trúc của rutin.

Perkin đã xác nhận được công thức phân tử của rutin là C27H30O16 và chỉ ra rằng
gốc đường gắn vào vị trí số 3 của quercetin. Charaux là người đầu tiên cô lập được
phần đường của rutin là 1 disaccharide và gọi tên nó là “rutinose”. Sau đó, Zemplén
và Gerecs đã thuỷ giải ruitin lấy từ hạt Rhamnus utilis bằng enzym và nhận được
rutinose.
-

Năm 2001, Nguyễn Văn Đậu đã thiết lập quy trình phân lập rutin trong nụ

hoa hoè, có nhiều nghiên cứu khác nhằm đánh giá hàm lượng rutin trong các thành
phần của cây và như trong nụ.
-

Một số nghiên cứu gần đây đã thành công trong việc chuyển hoá rutin thành

troxerutin – một dẫn xuất của rutin có nhiều tác dụng trong chống oxy hoá. Và có
nhiều nghiên cứu về phản ứng thuỷ phân rutin thành quercetin thiết lập chất chuẩn
định tính các hợp chất.
-

Năm 2010, có nghiên cứu chỉ ra hàm lượng rutin trong hoè thu hái tại 1 số

tỉnh của Việt Nam trồng có hàm lượng thay đổi và tại Thái Bình cho hàm lượng cao
nhất.
-

Bên cạnh đó tại Việt Nam, Hội đồng dược điển đã thiết lập chuyên luận riêng

cho dược liệu là hoè và các sản phẩm như viên nén rutin và viên nén rutin C.
-

Một số cây khác có chứa rutin

Các nguồn rutin được chiết xuất từ một số dược liệu được thống kê theo Bảng 1.1.

12

Bảng 1.1. Các nguồn có chứa Rutin khác [5].
Hàm lượng

STT

Tên khoa học

Họ

Tên

1

Stypholobium japonicum L.

Fabaceae

Hoè

6-38%

2

Eucalyptus macroryncha F.

Myrtaceae

Bạch đàn

10-19%

Mạch ba góc

5-8%

Táo ta

1,5%

3
4

Fagopyrum esculentum
Moench
Zizphus jujube Lamk

Polygonacea
e
Rhamnaceae

Rutin

1.3. SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.3.1. Sắc ký lớp mỏng
1.3.1.1. Nguyên tắc
- Tách bằng sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật tách các chất được tiến hành trên một lớp
mỏng bao gồm các hạt có kích thước đồng nhất, được kết dính trên một giá đỡ bằng
thủy tinh, nhôm hoặc chất dẻo. Lớp mỏng kết dính là pha tĩnh. Các hạt trong pha
tĩnh làm nhiệm vụ tách có thể theo cơ chế: phân bố, hấp phụ, trao đổi ion… Pha
động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp
và được hút lên bản sắc kí bởi lực mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên
tính phân cực của các thành phần trong dung dịch [1].
- Rf là đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số
lưu giữ Rf. Trị số này được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất
phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:
Rf = 𝑑𝑅 ⁄𝑑𝑀
Trong đó:
dR : khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm).