“trích ly enzyme bromelain từ thân, lá và trái khóm phế phẩm (ananas comosus)”
Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học
2012
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Sản lượng thành phẩm và phụ phẩm cả quả khóm tại các nhà máy chế
biến ở phía Bắc..................................................................................................
9
Bảng 2.2 Hoạt tính phân giải của bromelain ....................................................
14
Bảng 2.3 Hằng số Michaelis (pH 6,0 5°C) với các cơ chất khác nhau như sau: 14
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm 1............................................................................
25
Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm 2............................................................................
27
Bảng 4.1 Kết quả thí nghiệm chọn nguồn nguyên liệu khóm ............................
31
Bảng 4.2 Kết quả khảo sát tác nhân kết tủa là acetone ....................................
33
Bảng 4.3 Kết quả khảo sát tác nhân kết tủa là ammonium sulfate .................. .
34
Bảng 4.4 Kết quả khảo sát tác nhân kết tủa là ethanol………………………….36
Bảng 4.5 Kết quả tổng hợp ba tác nhân kết tủa là: acetone, ammonium sulfate và
ethanol..............................................................................................................
vi
37
Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học
2012
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1 Khóm Queen .......................................................................................
5
Hình 2.2 Khóm Spanish......................................................................................
6
Hình 2.3 Khóm Cayenne ...................................................................................
7
Hình 2.4 Khóm khoang đóng hộp ......................................................................
8
Hình 2.5 Nước khóm ..........................................................................................
8
Hình 2.6 Cấu trúc gốc carbohyrate của bromelain.............................................
12
Hình 2.7 Cách sắp xếp các aminoacid trong phân tử enzyme bromelain ..........
12
Hình 2.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính bromelain ...................
17
Hình 2.9 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme lên tốc độ phản ứng ........................
18
Hình 3.1 Sơ đồ thu nhận enzyme bromelain...................................................
24
Hình 3.2: Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 1.............................................................
25
Hình 3.3 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 2.............................................................
28
vii
Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
BAA: Benzoyl – L – Arginine amidez.
BAEE: Benzoyl – L – Arginine Ethyl Esther.
BAEM: Benzoyl – L – Arginine Methyl Esther.
Ctv: Cộng tác viên.
IU/ UI/ U: Đơn vị đo hoạt tính (IU: International Unit).
viii
2012
Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học
TÓM TẮT
Với mục tiêu tách chiết enzyme bromelain từ phụ phẩm khóm và nâng cao giá trị
kinh tế, đa dạng hóa sản phẩm từ cây khóm và góp phần tăng thu nhập cho nông
dân và bảo vệ môi trường. Đề tài “Trích ly enzyme bromelain từ thân, lá và
trái khóm phế phẩm (Ananas comosus)” được tiến hành. Kết quả nghiên cứu
cho thấy thân khóm là nguồn nguyên liệu thích hợp để trích ly enzyme bromelain.
Trong ba phương pháp kết tủa bromelain thì phương pháp kết tủa bằng acetone
và có ưu điểm hơn ammonium sulfate và ethanol. Dựa vào kết quả nghiên cứu
quy trình trích ly chế phẩm enzyme bromelain theo phương pháp kết tủa bằng
acetone được đề xuất.
Từ khóa: acetone, ammonium sulfate, ananas comosus, ethanol, enzyme
bromelain, thân khóm.
ix
2012
Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học
2012
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học, công nghệ enzyme đã trở
thành một ngành quan trọng và có nhiều đóng góp đáng kể vào sự phát triển
chung của công nghệ sinh học. Việc ứng dụng chế phẩm enzyme ngày càng được
chú trọng ở nhiều lĩnh vực khác nhau. Trong 20 năm cuối thế kỉ XX và các năm
đầu của thế kỉ XXI các enzyme khác nhau đã được ứng dụng. Ở Việt Nam bước
đầu đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng các enzyme trong chế biến nông sản, thực
phẩm, nhất là trong lĩnh vực sản xuất bia, rượu, chế biến tinh bột… Người ta có
thể thu nhận enzyme từ nhiều nguồn khác nhau như từ thực vật, nội tạng động
vật hay vi sinh vật. Trong đó, protease là nhóm enzyme được ứng dụng trong
nhiều lĩnh vực như: nông nghiệp, công nghệ thực phẩm, y học….
Bromelain là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứa nhóm
sulfuhydryl, có khả năng phân giải protein được thu nhận từ họ Bromeliaceae,
đặc biệt là ở cây khóm (thân và trái). Bromelain có nhiều tác dụng trong y học và
trong chế biến thực phẩm. Trong y học, bromelain được sử dụng làm giảm đau
nhanh sau phẫu thuật, giảm đau đối với các trường hợp viêm khớp, viêm đa
khớp, giảm thời gian tan các vết bầm tím và chống viêm. Bromelain còn có khả
năng chống đông tụ các tiểu cầu, làm giảm nguy cơ đột quỵ đối với các bệnh
nhân tim mạch, tăng khả năng hấp thu các loại thuốc đặc biệt là loại thuốc kháng
sinh như amoxicilline hay tetracycline và kiềm soát sự phát triển của các tế bào
ung thư (Rabelo et al., 2004). Trong công nghiệp thực phẩm, bromelain được sử
dụng để làm mềm thịt, thủy phân gan bò, để đông tụ sữa, phá đục bia, thủy phân
protein gluten trong sản xuất bánh mì làm khối bột nhào mềm dẻo hơn tăng
hương và chất lượng bánh (Lê Thanh Mai và ctv, 2005; Đặng Thị Thu và ctv,
2004; Lê Ngọc Tú, 2004)
Bromelain có mặt trong phụ, phế phẩm của khóm như: lõi trái, vỏ trái, thân,
chồi và lá. Phần phụ phế phẩm này chiếm một tỷ lệ lớn của lượng khóm nguyên
liệu đưa vào chế biến (khoảng 70%) (Nguyễn Bá Mùi, 2002). Ở Việt Nam, do
điều kiện khí hậu và đất đai thích hợp, cây khóm đã được phát triển mạnh từ
1
Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học
2012
những năm 30 của thế kỉ này. Đến nay diện tích trồng khóm ngày một tăng, trái
thơm ngon trở nên nguồn xuất khẩu có giá trị. Tuy nhiên, sự quan tâm đến cây
khóm mới chỉ thuần túy như một loại cây nhằm ăn trái. Để nâng cao giá trị kinh
tế của loại cây này cần khẳng định nó như một nguồn nguyên liệu protease có
khả năng ứng dụng rộng lớn. Vì thế, đề tài “Trích ly enzyme bromelain từ
thân, lá và trái khóm phế phẩm (Ananas comosus)” được tiến hành.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Tách chiết enzyme bromelain từ thân khóm, lá khóm và trái khóm phế
phẩm, nhằm nâng cao giá trị kinh tế, đa dạng hóa sản phẩm từ cây khóm, góp
phần tăng thu nhập cho nông dân và bảo vệ môi trường.
1.3 Nội dung nghiên cứu
- Thu nhận dịch enzyme bromelain từ các bộ phận của cây khóm: thân
khóm, lá khóm và trái khóm phế phẩm.
- Xác định hàm lượng protein và hoạt tính enzyme bromelain dịch chiết thô
từ thân khóm, lá khóm và trái khóm phế phẩm. So sánh hàm lượng protein và
hoạt tính enzyme bromelain giữa ba nguyên liệu để lựa chọn nguồn nguyên liệu
thích hợp.
- Ảnh hưởng loại tác nhân kết tủa (acetone, ammonium sulfate và ethanol)
đến hiệu suất thu hồi enzyme bromelain. So sánh, lựa chọn tác nhân kết tủa
bromelain thích hợp.
2
Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học
2012
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu chung về cây khóm
2.1.1 Nguồn gốc – phân bố
Nguồn gốc cây khóm là từ Nam Mỹ, trong khu vực tứ giác bao gồm vùng
phía Nam Brazil và Bắc Argentina nơi người da đỏ bản xứ đã tuyển chọn và
trồng trọt khóm lâu đời. Đối với những người ở cựu lục địa thì lịch sử trồng
khóm bắt đầu từ ngày 4/11/1493 – khi Christophe Colomb đổ bộ lên đảo
Guadeloup đã phát hiện và ăn thử trái khóm đầu tiên, từ đó trái khóm được phổ
biến khắp nơi. (http://diendan.truongmo.com, ngày truy cập 10/12/2011)
Tại Việt Nam:
Diện tích gieo trồng
Năm 1976: 16.800 ha
Năm 1990: 44.000 ha
Năm 1995: 24.037 ha
Năm 1998: 40.000 ha
(Trần Thế Tục, 2002)
Sản lượng:
Năm 1990: 467.851 tấn (trong đó miền Nam chiếm sản lượng là 424.326
tấn)
Năm 2007: 529.100 tấn. Tiền Giang là tỉnh có sản lượng khóm đứng đầu cả
nước (161.300 tấn)
(Trần Thế Tục, 2002)
Năng suất:
Miền Nam: 144 tạ/ha
Miền Bắc:
46 tạ/ha
(http://diendan.truongmo.com, ngày truy cập 10/12/2011)
3
Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học
2012
2.1.2 Đặc điểm thực vật của cây khóm
Khóm là loại cây ăn trái nhiệt đới có tên khoa học là Ananas comosus thuộc
họ Bromeliaceae. Trong họ có nhiều cây khí sinh (sống trong không khí), có rễ
khí sinh, dễ dàng hút sương, mưa nhỏ và các chất hòa tan trong đó. Một số đặc
điểm sinh học của khóm:
a. Rễ
Khóm chỉ có rễ chùm mọc cạn. Ở khóm trưởng thành, rễ phát triển yếu và
có khuynh hướng mọc ngang hơn là mọc sâu. Khoảng 80% số rễ mọc ở tầng đất
mặt khoảng 15-20cm. Rễ khóm có thể phân nhánh liên tục ăn lan cách gốc 1m có
khi đến 2m, nếu điều kiện môi trường thích hợp.
b. Thân
Thân khóm lúc mới trồng chỉ khoảng vài cm, nhưng khi thu hoạch thân có
thể mọc dài 20-30cm, thay đổi tùy giống, tùy loại con trồng và tùy điều kiện canh
tác và chăm sóc. Nếu bốc hết lá và cắt sạch các rễ phụ, thân khóm có dạng một
hình chùy ngắn.
c. Lá
Chiếm hơn 70% trọng lượng của toàn cây. Lá khóm có thể dài hay ngắn,
rộng hay hẹp và màu sắc lá cũng thay đổi tùy theo giống và tùy điều kiện ngoại
cảnh. Trên lá khóm, bìa phiến lá có gai hay không gai, gai nhiều hay gai ít tùy
giống. Trừ các lá non ở ngọn, các lá trưởng thành và lá già phía dưới đều có hình
máng xối. Lòng máng xối ngoài tác dụng hứng nước còn giúp cho lá cứng.
d. Hoa
Phát hoa khóm là một hoa kép trung bình có khoảng 100-150 hoa, trên cùng
một phát hoa các hoa khóm nở theo thứ tự từ dưới lên trên, và sau 15-20 ngày
các hoa mới nở xong. Trên một phát hoa các hoa xếp quanh trục chính theo
những đường xoắn ốc.
4
Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học
2012
e. Trái
Sau khi hoa thụ tinh, mỗi hoa trên trục phát hoa sẽ trở thành một mắt trên
trái khóm. Như vậy trái khóm về phương diện thực vật là một trái kép và mỗi mắt
khóm là một trái đơn.
f. Hạt
Hoa khóm có đặc điểm là giao phấn cùng một loại giống không thụ tinh
được và bầu noãn bị thoái hóa nhanh nên trái khóm thông thường không có hoặc
ít khi có hạt. bằng cách giao phấn chéo giữa các giống khóm khác nhau thì hoa
khóm có thể thụ tinh hình thành được các hạt nhỏ trong các mắt khóm. Hạt khóm
rất nhỏ có dạng hình trứng nhọn đầu, trung bình chỉ dài 3-5mm, ngang 1-2mm,
có lớp vỏ dày rất cứng ở bên ngoài, lớp phôi nhũ bên trong cũng cứng nên hạt
khóm cứng như đá, nếu không xử lí trước khi gieo thì rất khó nẫy mầm.
(Nguyễn Công Khanh và ctv, 1989)
2.1.3 Phân loại
Khóm có tất cả khoảng 60-70 giống, nhưng có thể gộp chung thành ba
nhóm chính:
a. Nhóm Hoàng Hậu (Queen)
Hình 2.1 Khóm Queen
(www.hadico.net/.../nongnghiep40VN.aspx, ngày truy cập 10/12/2011)
5
Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học
2012
Tán cây xòe tương đối rộng, lá ngắn và hẹp có rất nhiều gai và gai cong
dạng móc câu, chân lá màu hồng hơi đỏ, có rất nhiều chồi nách. Thịt trái vàng
đậm, giòn, hương khóm, vị chua ngọt đậm đà. Nhóm này có chất lượng cao nhất,
trên thế giới thường được dùng để ăn tươi và xuất khẩu. Dứa hoa, dứa tây, dứa
Victoria, khóm cũng thuộc nhóm này, nhóm này được trồng nhiều nhất trong ba
nhóm ở Việt Nam.
b. Nhóm Tây Ban Nha (Spanish)
Hình 2.2 Khóm Spanish
(http://a8.vietbao.vn, ngày truy cập 10/12/2011)
Tán cây hẹp, lá dài và hẹp thường có gai cũng có giống không có, chân lá
màu lục hơi đỏ, có vài chồi nách. Trái lớn hơn khóm Queen, mắt to và sâu. Thịt
trái màu vàng nhạt, có chỗ trắng, vị chua. Khóm ta, khóm mật thuộc nhóm này.
Nhóm này có chất lượng kém nhất, được trồng lâu đời và tập trung ở khu vực
Liễn Sơn (Tam Dương, Vĩnh Phú).
6
Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học
2012
c. Nhóm Caien (Cayenne)
Hình 2.3 Khóm Cayenne
(www.khuyennongtphcm.com, ngày truy cập 10/12/2011)
Tán cây xòe tương đối rộng, lá tương đối ngắn và rộng, chỉ có gai ở ngọn
lá, chân lá màu lục nhạt, có vài chồi nách. Trái lớn nhất, mắt phẳng và nông. Thịt
trái kém vàng, nhiều nước, ít ngọt hơn khóm Queen. Khóm độc bình, khóm tây
thuộc nhóm này. Vì phù hợp với chế biến công nghiệp, nhóm Caien được trồng
hầu hết các vùng dứa lớn trên thế giới (Thái Lan, Hawaii, Philippine….), nhưng
lại rất ít thấy ở Việt Nam.
(http://diendan.truongmo.com, ngày truy cập 10/12/2011)
2.1.4 Một số ứng dụng
Trong nước khóm có 12-15% đường, 0,5-0,8% acid. Cứ 100 g nước khóm
có 8,5 mg vitamin C, 0,3 mg Caroten, một ít vitamin B1, B2, PP… Trong nước
khóm còn có enzyme bromelain gồm nhiều enzyme phân giải protein có tác dụng
kích thích tiêu hóa.
(http://diendan.truongmo.com, ngày truy cập 10/12/2011)
Trái khóm ngoài sử dụng để ăn tươi còn dùng làm nguyên liệu chế biến đồ
hộp, mứt khóm, kẹo khóm, rượu vang, nước giải khát, điều chế acid citric và
enzyme bromelain.
7
Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học
2012
Hình 2.4 Khóm khoang đóng hộp
(http://www.phiasiaholdings.com, ngày truy cập 10/12/2011)
Hình 2.5 Nước khóm
(http://img-m.24hstatic.com, ngày truy cập 10/12/2011)
Cứ 1 tấn quả khóm sau khi ép nước, còn lại bã chế biến ra được 30 kg thức
ăn khô cho gia súc. Bã khóm sau 1năm ủ chứa 1,27% đạm, 0,08% kali, 0,18%
canxi, dùng làm phân bón rất tốt. Sau khi thu hoạch, toàn bộ thân lá và chồi
(khoảng 60 tấn/ha) đưa vào nhà máy nghiền bột, ép thành tấm (đạt khoảng 12
8
Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học
2012
tấn/ha) dùng làm thức ăn gia súc. (http://diendan.truongmo.com, ngày truy cập
10/12/2011)
2.1.5 Nguồn phế phụ phẩm khóm
Phế phụ phẩm khóm bao gồm chồi ngọn của quả khóm, vỏ cứng ngoài,
những vụn nát trong quá trình chế biến khóm, bã khóm ép và toàn bộ lá của cây
khóm phá đi trồng mới. Hàng năm các loại phế phụ phẩm này ở các nông trường
khóm và các cơ sở chế biến khóm rất lớn. Ước tính 1ha khóm phá đi để trồng lại
sau 2 vụ thu quả sẽ để lại 50 tấn lá khóm; 1 tấn khóm đưa vào chế biến theo quy
trình chế biến khóm đông lạnh cho 0,25 tấn chính phẩm và 0,75 tấn phụ phẩm,
tức là cứ 4 kg khóm nguyên liệu cho 1kg thành phẩm; 1 tấn khóm đưa vào chế
biến theo quy trình đóng hộp được 0,35 tấn chính phẩm và 0,65 tấn phụ phẩm
(http://www.dostbinhdinh.org.vn, ngày truy cập 10/12/2011).
Bảng 2.1 Sản lượng thành phẩm và phụ phẩm cả quả khóm tại các nhà máy chế
biến ở phía Bắc
Năm
Chỉ tiêu
1998
1999
2000
Sản lượng quả khóm (tấn)
5518.0
7033.0
16300.0
Thành phẩm khóm (tấn)
1682.9
2109.0
4808.5
Phụ phẩm khóm (tấn)
3835.1
4923.1
11491.5
- Chồi ngọn (tấn)
1655.4
2145.1
4890.4
- Bã khóm (tấn)
2179.7
2778.0
6601.5
2.28
2.33
2.38
Trong đó:
Tỷ lệ phụ phẩm/chính phẩm
(lần)
Nguồn: Nguyễn Bá Mùi, 2002
Phụ phẩm khóm có hàm lượng chất xơ cao, nghèo protein nên có thể sử
dụng làm thức ăn cho trâu bò với tỷ lệ thích hợp. Bên cạnh đó, phụ phẩm khóm
có hàm lượng đường dễ tan cao, thuận lợi cho quá trình lên men nên có thể ủ
chua làm thức ăn để thay thế một phần thức ăn thô trong khẩu phần ăn của gia
súc. Như vậy, việc chúng ta tận dụng được nguồn phụ phẩm này từ các nhà máy
9
Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học
2012
chế biến sẽ có ý nghĩa rất lớn trong việc bảo vệ môi trường, nâng cao hiệu quả
kinh tế. Hơn thế nữa, enzyme bromelain thu được từ phế phụ phẩm có ý nghĩa rất
lớn trong nhiều ngành công nghiệp hiện nay.
(http://www.dostbinhdinh.org.vn, ngày truy cập 10/12/2011).
2.2 Giới thiệu về enzyme bromelain
2.2.1 Khái niệm về enzyme
Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra các quá trình trao đổi chất.
Sự trao đổi chất ngừng thì sự sống không còn tồn tại. Quá trình trao đổi của một
chất là tập hợp các quy luật của rất nhiều các phản ứng hóa học khác nhau. Các
phản ứng hóa học phức tạp này có liên quan chặt chẻ với nhau và điều hòa lẫn
nhau. (http://d.violet.vn, ngày truy cập 09/12/2011)
Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein và có tính đặc hiệu
cao. Mỗi enzyme có khả năng xúc tác cho một hoặc một số phản ứng nhất định.
Hoạt tính của enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất được chuyển hóa hoặc lượng
sản phẩm tạo thành trên một đơn vị thời gian càng lớn. Vì vậy có thể đánh giá
hoạt tính của enzyme bằng cách xác định tốc độ chuyển hóa cơ chất hoặc tốc độ
tích lũy sản phẩm phản ứng. (Nguyễn Hoài Hương, 2009)
2.2.2 Đặc điểm chung về enzyme bromelain
Bromelain trái là E.C.3.4.22.33
Bromelain thân là E.C. 3.4.22.32
Tên gọi khác : bromelin, bromeline.
Tên khoa học và y học : sulfuhydryl proteolytic enzyme, cysteine
protease.
Tên thương mại : Bromanase (Kramer – Novis) Bromelain 2400
maximum Strength (Vitalize Corp)
Enzyme Bromelain là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứa nhóm
sulfuhydryl, có khả năng phân giải protein được thu nhận từ họ Bromeliaceae,
đặc biệt là ở cây khóm (thân và trái).
10
Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học
2012
(http://www.scielo.br.com, ngày truy cập 10/12/2011)
Bromelain chiếm 50% protein trong trái khóm. Tùy theo nguồn thu nhận
mà người ta phân biệt bromelain thân hay bromelain trái. Bromelain thân là
nhóm enzyme có giá trị kinh tế. Nó có khả năng thủy phân khá mạnh và hoạt
động tốt ở pH từ 6-8. Bromelain có hoạt tính xúc tác sự phân giải protein tương
tự như papain trong mủ đu đủ hay ficin trong cây thuộc họ Sung. Enzyme
bromelain có trọng lượng phân tử khoảng 33.000 Da, lớn gấp 1,5 lần papain.
Thịt trái khóm chỉ có hoạt tính enzyme bromelain kể từ 3 tháng trước khi
chín, trong đó hoạt tính bromelain cao nhất là khoảng 20 ngày trước khi chín.
Khi trái chín, hoạt tính bromelain giảm xuống nhưng không mất hẳn (Nguyễn
Đức Lượng, 2004).
2.2.3 Tính chất của enzyme bromelain
Thành phần chủ yếu của bromelain có chứa nhóm sulfhydryl thủy giải
protein. Trong dịch chiết bromelain còn có chứa một ít peroxydase, phophatase
acid và chất ức chế protease.
Dịch chiết bromelain toàn phần có hoạt động trong khoảng pH 4,5-9,8.
Bromelain được chiết tách từ các phần khác nhau trên cây khóm và bromelain từ
các nguồn khác nhau sẽ có hoạt động sinh lý khác nhau nhưng hoạt tính thủy
phân protein thì giống nhau. Bromelain không ổn định với nhiệt độ do đó các
hoạt động sinh lý của nó sẽ giảm đi nếu quá trình chiết tách hay điều kiện bảo
quản không thích hợp.
Bromelain có thể thấm qua dạ dày và ruột của động vật. Nồng độ cao nhất
của bromelain được tìm thấy trong máu sau khi ăn một giờ, tuy nhiên hoạt động
thủy phân protein của nó bị bất hoạt nhanh chóng có lẽ là do tác động của các
protease nội sinh và yếu tố α-2-macroglobuline của huyết thanh.
2.2.4 Cấu tạo hóa học
Bromelain thân là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật
khác như papain, ficin ở chổ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm
3 manose, 2 glucosamine, 1 xylose và 1 fructose. Gốc carbohydrate này liên kết
11
Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học
2012
với sợi polypeptide. Trong sợi hydratecarbon này dường như một nửa không có
liên quan đến cơ chế xúc tác của phân tử. Người ta đề nghị cấu trúc gốc
carbohydrate của phân tử bromelain như sau:
Hình 2.6 Cấu trúc gốc carbohydrate của bromelain
Khi phân tích thành phần acid amin ở bromelain thân và bromelain trái thì
tùy theo phương pháp thu nhận và phương pháp phân tích mà có thành phần acid
amin thay đổi khác nhau. Bromelain có thành phần acid amin thay đổi trong
khoảng 321-144 acid amin và bromelain trái là 283-161 acid amin.
Bromelain thân là một sợi polypeptide có acid amin ở đầu amine là valine
và ở đầu carbohyrate là glycine, còn bromelain trái có acid amin ở đầu amine là
alanine.
2.2.5 Cấu trúc không gian của bromelain
Khi phân tích cấu trúc bậc một của enzyme bromelain Murachi và Busan
nhận thấy cách xắp xếp acid amin trong phân tử bromelain như sau (Nguyễn Đức
Lượng, 2004)
Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp –
- Gly – Cys – Lys –
Hình 2.7 Cách sắp xếp các acid amin trong phân tử enzyme bromelain
12
Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học
2012
Bromelain là một protease trong tâm hoạt động có chứa cysteine và hai sợi
polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối (– S – S –). Phân tử có dạng hình cầu
do có cách sắp xếp phức tạp.
Trong phân tử bromelain thân có chứa nhóm sulfhydryl có vai trò chủ yếu
trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Ngoài
ra, trong phân tử còn có các ion Zn 2+ có vai trò duy trì cấu trúc không gian của
enzyme.
2.2.6 Tính chất vật lý
Trọng lượng phân tử: 33200-33500 Da
Hằng số lắng: 2,73 S
Thể tích riêng phần: 0,743 ml/g
Hằng số khuếch tán: 7,77x107 cm2
Độ nhớt bên trong: 0,039 dl/gam
Tỷ số ma sát f/fo: 1,26
Điểm đẳng điện pI : 9,55
Sự hấp thụ AL%cm: 20,1a cm
(Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.2.7 Hoạt tính của bromelain
a. Hoạt tính phân giải
Bromelain có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase.
Bromelain thân có thể thủy phân cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp như
hemoglobin, casein, gelatin, BAA (Benzoyl – L – Arginine amidez), BAEE
(Benzoyl – L – Arginine Ethyl Esther), BAEM (Benzoyl – L – Arginine Methyl
Esther (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Khả năng phân giải cơ chất tự nhiên của bromelain
13
Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học
2012
Bảng 2.2 Hoạt tính phân giải của bromelain
Hoạt tính phân giải (UI/mg)
Cơ chất
Bromelain thân
Bromelain trái xanh
Bromelain trái chin
Casein
7,4
4,0
3,0
BAA
3,7
9,1
7,2
Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004
Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelain thân cao hơn
bromelain trái xanh và bromelain trái chín.
Khả năng phân giải cơ chất nhân tạo của bromelain
Bromelain trái xanh có hoạt tính phân giải BAA cao hơn bromelain thân và
bromelain trái chín.
Bảng 2.3 Hằng số Michaelis (pH 6,0 5°C) với các cơ chất khác nhau như sau:
Enzyme cơ chất
BAA
BAEE
BAEM
Bromelain thân
1,2*10-3
17*10-1
3,2*10-2
Papain
3,9*10-2
1,89*10-3
Ficin
4,8*10-3
2,5*10 -2
Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004
BAA: Benzoyl – L – Arginine amidez.
BAEE: Benzoyl – L – Arginine Ethyl Esther.
BAEM: Benzoyl – L – Arginine Methyl Esther.
Theo Murachi et al., (1964) với cơ chất là hemoglobin thì bromelain mạnh
gấp 4 lần papain, với casein thì tương đương, với cơ chất BAA, BAEE thì kém
hơn.
14
Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học
2012
Như vậy, hằng số xúc tác của bromelain đối với BAEE gấp 140 lần so với
BAA, khác hẳn trường hợp papain và ficin.
Ý nghĩa của hằng số Michaelis-Menten: chính là giá trị nồng độ cơ chất khi
tốc độ phản ứng bằng ½ tốc độ cực đại. Km có đơn vị là Molar, đơn vị nồng độ.
Hằng số Michaelis là hằng số rất quan trọng. Nó xác định ái lực của enzyme với
cơ chất. Km càng nhỏ thì ái lực càng lớn, tốc độ phản ứng càng cao vì thế tốc độ
cực đại Vmax đạt ở giá trị nồng độ cơ chất thấp.
b. Cơ chế tác dụng
Khi thủy phân protein, bromelain tác động nhiều nhất vào những nối có
glycine, alanine, leucine, valine, phenylalanine, tyrosine
Theo Doi E et al., (1974) bromelain thô có tác dụng như một carboxypeptitase (từ dịch tụy) thủy phân các liên kết peptide tận cùng cạnh nhóm
carboxyl tự do của cơ chất, nhất là khi acid amine tận cùng có nhân thơm.
Hầu hết các tác giả đều thừa nhận vai trò của nhóm –SH của cystein, nhóm
imidazole của histidine và nhóm disulfur trong hoạt động thủy phân của
bromelain. Nhóm –SH tham gia tạo thành acyl-thioester trung gian với nhóm
carboxyl của cơ chất (nơi các liên kết peptide bị cắt). Nhóm imidazole làm chất
trung gian nhận gốc acid và chuyển cho nhóm anion của chất nhận khác. Cầu nối
S-S có vai trò duy trì cấu trúc không gian của bromelain. Casein và hemoglobin
là hai cơ chất tự nhiên được dùng nhiều nhất. Đầu tiên, bromelain kết hợp với
protein và thủy phân sơ bộ cho ra polypeptide và acid amine. Protein kết hợp với
nhóm –SH của enzyme khiến nó bị ester hóa rồi nhóm imidazole sẽ khử ester để
giải phóng enzyme, acid amin và peptide.
Ở giai đoạn đầu Zn2+ rất quan trọng, chúng kết hợp với nhóm –SH của tâm
hoạt động hình thành mercaptid phân ly yếu (nhưng vẫn còn khả năng tạo liên
kết phối trí bổ sung với các nhóm chức năng khác của phân tử protein như amine,
carboxyl…)
Enzyme –SH +Zn2+ => enzyme-S-Zn + H+
15
Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học
2012
Do vậy nhóm –SH trong tâm hoạt động đã bị ester hóa bởi cơ chất, cấu trúc
không gian được bảo vệ ổn định.
c. Các đơn vị hoạt độ của enzyme
Đơn vị hoạt động của enzyme được coi là lượng enzyme có khả năng xúc
tác làm chuyển hóa một lượng cơ chất nhất định trong một đơn vị thời gian nhất
định ở điều kiện tiêu chuẩn. Theo quy ước quốc tế có một số đơn vị hoạt độ sau:
Đơn vị IU (đơn vị quốc tế)
Là lượng enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa được một micromole cơ
chất sau thời gian một phút ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 IU = µM cơ chất (10-6 M/phút)
Đơn vị katal
Là lượng enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa một mol cơ chất sau thời
gian một giây ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 Kat = 1 Mol cơ chất/giây
1 IU = 1/60 x 10 -6 kat = 16,67 nkat
Hoạt lực enzyme hay lực xúc tác được biểu diễn bằng một số đơn vị hoạt độ
enzyme.
Hoạt độ riêng
Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzyme được biểu diễn bằng một đơn vị
hoạt độ enzyme trên đơn vị khối lượng protein.
IU hoặc kat/1 mg protein
2.2.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelain
a. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Enzyme bromelain có hoạt tính cực đại trong khoảng nhiệt độ 50 – 60°C.
Độ bền nhiệt của bromelain kém hơn papain. Ở 70°C, bromelain bị biến tính
nhanh gấp 20 lần papain ở 75°C. Tuỳ thuộc cơ chất mà nhịêt độ tối ưu khác nhau
16